Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT)

1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV

Mặc dù có nhiều ứng dụng khác nhau và có khả năng biểu hiện gen hiệu quả, vector SFV vẫn cần được cải tiến thêm. Sau đây là các yếu tố có thể cải tiến trong hệ vector SFV.

1.2.4.1 Vùng nhân dòng đa điểm

Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế (chỉ có vị trí nhận biết của 3 enzym), chúng ta có thể cải tiến bằng cách bổ sung thêm các vị trí nhận biết enzym giới hạn mới giúp việc nhân dòng các gen sẽ trở nên linh hoạt và thuận lợi nhờ có thể lựa chọn thêm nhiều tổ hợp các enzym giới hạn phục vụ cho nhân dòng và biểu hiện các gen GPCR mong muốn.

1.2.4.2 Yếu tố tăng cường dịch mã

Frolov và Schlesinger (1994) đã tìm thấy đoạn trình tự tăng cường dịch mã nằm ở gen mã hóa vỏ capsit xuất hiện ở Sindbis virut, một virut có cấu trúc khá tương đồng và cùng nhóm phân loại với SFV[12]. Nhiều nghiên cứu sau này đã cho thấy, khi thêm vùng tăng cường trên vào các vector biểu hiện, không những không làm giảm tốc độ phiên mã mARN mà còn tăng cường khả năng

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

20

dịch mã lên 10 đến 100 lần [10]. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy trên SFV có 102 nucleotit đầu tiên mã hóa cho protein vỏ capsid cũng có khả năng tăng cường dịch mã cho những gen xuôi chiều và cùng nằm trong khung đọc mở với đoạn trình tự này [48]. Thêm đoạn trình tự mã hóa cho vỏ capsit SFV vào trước vị trí nhân dịng có thể biểu hiện GPCR hàm lượng cao như một protein liên hợp với protein vỏ capsit.

1.2.4.3 Gắn FLAG-tag

FLAG-tag hay FLAG octapeptit có bản chất là đuôi polypeptit gồm 8 axit amin ưa nước có thể gắn vào protein quan tâm (Bảng 1). Cấu trúc của FLAG-tag đã được tối ưu để tương thích với protein mà nó gắn vào. Đây là đoạn polypeptit ưa nước hơn so với hầu hết các epitop thông thường khác và do vậy ít có khả năng gây biến tính hoặc bất hoạt các protein mà nó gắn vào. FLAG peptit liên kết với kháng thể M1. Protein tái tổ hợp có gắn đi FLAG-tag có thể được phân lập bằng sắc kí ái lực và được xác định bằng kháng thể tương tác với đoạn FLAG-tag. Protein tái tổ hợp được gắn FLAG-tag đã được biểu hiện trong nhiều loại tế bào, từ vi khuẩn tới nấm men và tế bào động vật có vú [29].

FLAG-tag có thể được gắn vào đầu N hoặc đầu C của phân tử protein tái tổ hợp, tuy nhiên có nhiều kháng thể chỉ có thể nhận biết các epitop khi chúng ở đầu tận cùng N của protein. FLAG-tag có thể được sử dụng liên hợp với các tag có ái lực khác như His-tag hay myc-tag. Ngồi ra, FLAG-tag ở đầu tận cùng N có thể được loại bỏ dễ dàng từ các protein sau khi chúng đã được phân lập bằng cách xử lý với protease như enterokinase [51].

1.2.4.4 Đuôi polyhistidin (His-tag) và vị trí thrombin

Tinh sạch protein với đi polyhistidin (His-tag) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất và đã áp dụng thành công trong các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở nhân sơ, nấm, các tế bào động vật có vú và tế bào côn trùng nhiễm virut baculo [47]. Histidin là axit amin tương tác mạnh nhất với các ion kim loại nhờ dễ dàng hình thành liên kết giữa nhóm cho điện tử trên vịng imidazole của nó với kim loại. Polyhistidin (His-tag) là một đoạn axit amin chứa

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

21

ít nhất 5 histidin, thường được gắn vào đầu tận cùng C hoặc N của protein tái tổ hợp và có thể được loại bỏ bởi các endopeptidase như Qiagen TAGZyme.

His-tag thường được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp qua sắc kí ái lực của đi His-tag với các ion kim loại chuyển tiếp như Co2+

, Ni2+, Cu2+, Zn2 + được cố định trên chất nền và các chuỗi axit amin đặc hiệu [20]. His-tag cũng được sử dụng để phát hiện protein trong các phản ứng tương tác sử dụng kháng thể Anti-HisG, phản ứng ELISA, Western blot cũng như các phản ứng phân tích miễn dịch khác. Đi His–tag có thể được loại bỏ nhờ có vị trí cắt thrombin có trình tự SGLVPR (liên kết peptit sẽ cắt giữa V và P). Vị trí thrombin được gắn vào nhiều hệ vector cho phép loại bỏ vùng ngược chiều, chủ yếu là các đuôi ái lực.

Hệ vector SFV là một hệ thống tiềm năng với nhiều ưu điểm, có thể được nghiên cứu cải tiến thêm nhằm phục vụ cho biểu hiện protein màng nói chung và các GPCR nói riêng ở mức độ cao. Mặc dù vậy chưa có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến hệ vector này. Ở Việt Nam, sử dụng hệ SFV để biểu hiện các GPCR là hướng nghiên cứu mới song có nhiều tiềm năng phục vụ cho các nghiên cứu dược lý phân tử và sàng lọc dược chất từ các nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát

triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam”với mục tiêu nghiên cứu chính là: phát triển hệ vector SFV

dựa trên vector SFV cơ bản cho phép biểu hiện các GPCR tái tổ hợp mà bước đầu là gen mã thụ thể Neurokinin 1 với đủ hoạt tính với hiệu suất cao.

Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, chúng tôi đã tiến hành một số nội dung nghiên cứu sau:

1) Hồn thiện quy trình chuẩn bị các lơ tế bào khả biến DH5α có hiệu suất biến nạp đủ cao cho phép nhân dòng tất cả các plasmit của hệ vector SFV cơ bản một cách thuận tiện, dễ dàng.

2) Chuyển hệ vector SFV cơ bản và được cải biến vào các tế bào khả biến DH5α để lưu giữ, nhân dòng.

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

22 3) Cải biến hệ vector SFV cơ bản.

4) Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản và hệ vector SFV cải biến.

5) Sàng lọc chủng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp SFV mang gen mã hóa NK1.

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

23

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Các chủng vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α đã đột biến, có những thiếu hụt thuận lợi cho biến nạp và nhân nhanh plasmit hoặc cosmit tái tổ hợp mua của hãng Invitrogen (Mỹ).

- Chủng vi khuẩn chứa plasmit pJET1.2 mang gen tái tổ hợp mã hóa cho thụ thể NK1 (pJET1.2-NK1) được cung cấp bởi PGS.TS Võ Thương Lan, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.

Hình 7. Cấu trúc của vector pJET1.2

Trình tự đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 được đưa vào vetor pJET1.2: GATATGGATAACGTCCTCCCGGTGGACTCAGACCTCTCCCCAAACATCTCCACTAACACCACGGTCATTG Mã mở đầu TGGTGACCTCTGTGGTGGGCAACGTGGTAGTGATGTGGATCATCTTAGCCCACAAAGGAATGAGGACAGT GACGAACTATTTTCTGGTGAACCTGGCCTTCGCGGAGGCCTCCATGGCTGCATTCAATACAGTGGTGAAC TTCACCTATGCTGTCCACAACGAATGGTACTACGGCCTGTTCTACTGCAAGTTCCACAACTTCTTTCCCA TCGCCGCTGTCTTCGCCAGTATCTACTCCATGGCGGCTGTGGCCTTTGATAGGTACATGGCCATCATACA TCCCCTCCAGCCCCGGCTGTCAGCCACAGCCACCAAAGTGGTCATCTGTGTCATCTGGGTCCTGGCTCTC

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 24 CTGCTGGCCTTCCCCCAGGGCTACTACTCAACCACAGAGACCATGCCCAGCAGAGTCGTGTGCATGATCG AATGGCCAGAGCATCCGAACAAGATTTATGAGAAAGTGTACCACATCTGTGTGACTGTGCTGATCTACTT CCTCCCCCTGCTGGTGATTGGCTGTGCATACACCGTAGTGGGAATCACACTATGGGCCAGTGAGATCCCC GGGGACTCCTCTGACCGCTACCACGAGCAAGTCTCTGCCAAGCGCAAGGTGGTCAAAATGATGATTGTCG TGGTGTGCACCTTCGCCATCTGCTGGCTGCCCTTCCACATCTTCTTCCTCCTGCCCTACATCAACCCAGA TCTCTACCTGAAGAAGTTTATCCAGCAGGTCTACCTGGCCATCATGTGGCTGGCCATGAGCTCCACCATG TACAACCCCATCATCTACTGCTGCCTCAATGACAGGTTCCGTCTGGGCTTCAAGCATGCCTTCCGGTGCT GCCCCTTCATCAGCGCCGGCGACTATGGGGGGCTGGAAATGAAATCCACCCGGTATCTCCAGACCCAGGG CAGTGTGTACAAAGTCAGCCGCCTGGAGACCACCATCTCCACAGTGGTGGGGGCCCACGAGGAGGAGCCA GAGGACGGCCCCAAGGCCACACCCTCGTCCCTGGACCTGACCTCCAACTGCTCTTCACGAAGTGACTCCA AGACCATGACAGAGAGCTTCAGCTTCTCCTCCAATGTGCTCTCCTAGGCCACAGGGCCTTTGGCAGGTGC Mã kết thúc AGCCCCCACTGCCTTTGACCTGCCTCCCTTCATGCATGGAAATTCCCTTCATCTGGAACCATCAGAAACA CCCTCACACTGGGACTTG 2.1.2 Hệ vector SFV

Hệ vector SFV cơ bản gồm vector pSFV và vector pHelper là quà tặng từ TS. Kenneth H. Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) tặng có cấu trúc như trình bày ở phần tổng quan (xem mục 1.2.2, các hình 4 – 6).

2.1.3 Các cặp mồi PCR và các đoạn oligonucleotit dùng để cải biến

vector

Các cặp mồi PCR dùng để nhân các phân đoạn ADN đặc hiệu của vector SFV hoặc của gen NK1 được thiết kế bằng các phần mềm (Primer Premier 5 và PerPrimer, Ver 1.1.14) có vị trí được minh họa trên hình 8 và có trình tự được trình bày trên bảng 4. Các đoạn oligonucleotit được dùng để cải biến vector, đoạn trình tự đa nhân dòng O-M7 và đoạn nối (linker) M3 – M4 lần lượt được trình bày trên bảng 5, hình 9.

Tất cả các mồi PCR và các đoạn oligonucleotit được đặt mua từ hãng IDP (Mỹ) qua Công ty TNHH vật tư KHKT Đông Dương (Hà Nội, Việt Nam).

Bảng 4. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu Tên Tên

mồi

Trình tự (5’-3’) Mục đích

F-N TGACCTGTTATACACCTCTACG Nhân các trình tự của

SFV

R-N AGGCCCGGGATGACCACTCTTC

807 GCCCATCTATGACAACAAG

809 GTGCGATACCCGACATG

808 ACCTCCAACTGCTCTTCAC Nhân các trình tự của

gen NK1

NK1 F CGAAATGGATAACGTCCTCCC

NK1 R CAAGTCCCAGTGTGAGGGTG

NK1 R1 GCCAGCAGATGGCGAAGG

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

25

Hình 8. Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1

Bảng 5. Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu Tên Tên mồi Trình tự (5’-3’) Mục đích O-M1 AGCGAGATCTTGACTACAAGGACGACGAT BglII GACAAGCACCACCATCATCACCACCATCA CCATCACAGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTG GG TCTGGATCCTA BamHI

Tạo linker chứa trình tự của Flag-tag, His- tag, vị trí Thrombin (gọi là đoạn O-M6)

M1- M6 ATCAGGATCCAGACCCA O-M2 ATTGGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAA BamHI TCGATGCATCCTAGGGCCCGGGCGC XmaI

Tạo ra linker chứa vùng nhân dòng đa điểm cải tiến O-M7 M2-

M7

GCGCCCGGGCCCTAGGATGCATCGA

O-M3 GATCGGATCCGC Tạo linker M3-M4

O-M4 TTAGCGGATCC

(Màu xám: đoạn chứa trình tự của Flag-tag, màu vàng: đoạn chứa trình tự của His10-tag, màu hồng: đoạn chứa trình tự của Thrombin)

Hình 9. Trình tự vị trí nhân dịng đa điểm của đoạn O-M7

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

26

2.1.4 Các nhóm hóa chất chính được sử dụng

- Nhóm hóa chất cải biến vector SFV gồm có: các hóa chất sử dụng trong phản ứng nhân bản gen cần phân tích (PCR) như đệm, dNTP, MgCl2, các

polymerase, mồi đặc hiệu, các enzym giới hạn và đệm tương ứng với các enzym. - Nhóm hóa chất chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp plasmit vào tế bào DH5α gồm dung dịch CaCl2 0.1M, dung dịch MgCl2 2M, dung dịch MgCl2- CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2), dung dịch Glucosse 1M, dung dịch KCl 250 mM, môi trường LB lỏng để tăng trưởng chủng ban đầu, kháng sinh thích hợp (ampicillin), mơi trường SOC.

- Nhóm các hóa chất tách plasmit gồm Sol I ( glucose 50 mM; đệm Tris- HCl, 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM); Sol II (NaOH 0,2N, 1% SDS); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml, CH3COOH băng: 11,5 ml, H2O: 28,5 ml, Rnase 10 mg/ml không chứa DNase). Phenol: chloroform: isoamylalcohol được trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thể tích, trong đó phenol có pH 8.0; ethanol; đệm TE (10 mM Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 có chứa EDTA 1mM); isopropanol; dung dịch axetate kali 5M.

- Nhóm hóa chất cho phản ứng cắt – nối ADN được cung cấp bởi Fermentas gồm các enzyme giới hạn FastDigest, T4 DNA ligase, FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase (FTAP), đoạn Klenow.

- Nhóm các hóa chất điện di gồm agarose, đệm TAE, ethidium bromide, thang chuẩn ADN.

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR gồm AccuPrep PCR Purification Kit (K- 3034-1 của Bioneer), Kit thơi gel GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas).

Các hố chất đều đảm bảo độ tinh sạch và được cung cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới: Bioneer (Hàn Quốc), Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức), IDP (Mỹ), Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ),…

2.1.5 Trang thiết bị nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện bằng các trang thiết bị, máy móc phục vụ nghiên cứu sinh học phân tử - tế bào tại Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein và Phịng thí nghiệm Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học

27