(a) Ảnh điện di: M-thang chuẩn 1kb, (-)-đối chứng âm, C- sản phẩm PCR (b) Kích thước thang chuẩn 1kb (M, Fermentas)
Bảng 12. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR
khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt
H2O 19.2 Thời gian biến tính đầu tiên:
940C, 5 phút Lặp lại 45 chu kì: + Biến tính: 940 C, 30 giây + Gắn mồi: 540 C, 30 giây + Tổng hợp: 720 C, 90 giây
Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
10X Taq pol Buffer 3.0
MgCl2 25 mM 0.8
dNTP 2mM 2.0
F-N/ R-N 2 µM 1.0
Taq pol 1 u/µl 1.0
ADN 2.0
Tổng 30.0
Để đảm bảo đoạn gen được nhân lên có đoạn trình tự có khả năng tăng cường dịch mã (102 Nu đầu tiên trong khung đọc mở mã hóa cho vỏ capsit), trước khi xử lý enzym để thu đoạn chèn 1, sản phẩm PCR được tinh sạch và đem đi giải trình tự. Kết quả giải trình tự (Hình 15) cho thấy đoạn gen nhân lên có một sai khác so với trình tự khuôn pHelper: thay T bằng C ở vị trí 132 tương ứng với sự thay đổi bộ ba mã hóa CCT thành CCC. Tuy nhiên, hai bộ ba mã hòa này đều mã hóa cho Prolin nên thay đổi nucleotit trên không làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của của protein mà nó mã hóa.
M (-) C
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
39
Hình 15. Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại
đoạn gen mã vỏ capsit của SFV
3.2.2 Thu đoạn chèn số 2
Không thể gắn trực tiếp đoạn chèn 1 có đầu dính EcoRI/ XmaI vào pSFV vì pSFV có 4 vị trí cắt của EcoRI. Chính vì vậy, chúng tôi thiết kế một đoạn chèn thứ 2 có 2 đầu dính BglII/EcoRI gắn trước đoạn chèn 1, làm đoạn trung gian giúp nối đoạn chèn 1 vào vector pSFV cơ bản mở vòng bằng BglII/XmaI. Đoạn chèn số 2 được thu từ pHelper bằng phản ứng cắt phối hợp nhiều enzym có vị trí trên vector như minh họa trên hình 16.
Hình 16. Vị trí của đoạn chèn thứ 2 (đoạn màu xanh) trong pHelper
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
40
Sau nhiều phản ứng tối ưu nồng độ enzym cắt và ADN, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% như ở Hình 17a cho thấy phản ứng cắt liên hợp đã xảy ra hoàn toàn cho ra 4 băng sáng, nét có kích thước phù hợp với lý thuyết là 1355 bp, 5993 bp, 676 bp và 313 bp. Băng ADN có kích thước xấp xỉ 700bp được cắt và thu hồi bằng kit thơi gel GeneJET Gel Extraction Kit ®(Fermentas). Ảnh điện di trong Hình 17c cho thấy tôi đã thu hồi được thành công đoạn chèn số 2 có chất lượng đảm bào để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt pHelper bằng BglII, EcoRI và AccI được trình bày trong Bảng 13.
(a) (b) (c) (d)
Hình 17. Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1%.
(a) Làn 1: sản phẩm cắt pHelper bằng BglII/EcoRI/ AccI, làn 2: thang chuẩn 1kb. (b): thang chuẩn 1kb (Fermentas). (c) Làn 1: đoạn chèn 2 sau khi thôi gel, làn 2:
thang chuẩn 100bp. (d): thang chuẩn 100bp (Fermentas)
Bảng 13. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
10X Buffer Tango 2 20 µl hỗn hợp ủ 370C qua đêm
ADN 5 BglII 1 AccI 1 H2O 11 Thêm: FastDigest EcoRI 1 25 µl hỗn hợp ủ 370 C - 10 phút. Bất hoạt ở 800 C -20 phút 10X FastDigest Buffer 0.5 H2O 3.5 1 2 1 2
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
41
3.2.3. Sàng lọc khuẩn lạc mang vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8
Hỗn hợp sau phản ứng nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ
sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml, chúng tơi thu được hàng trăm khuẩn lạc. Từ tập hợp này, chúng tôi thu ngẫu nhiên 74 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn ADN vector cải tiến pSFV-M7 và 65 khuẩn lạc lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn vector cải tiến pSFV-M8 bằng phản ứng colony PCR dùng cặp mồi 807/809. Đây là 2 cặp mồi nhân lên đoạn ADN chứa vùng cải tiến gồm có FLAG-tag, His-tag, vị trí Thrombin và vùng nhân dịng đa điểm của 2 vector cải tiến, có kích thước 634 bp. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR được trình bày trên bảng 14.
Bảng 14. Thành phần và điều kiện phản ứng colony PCR sàng lọc khuẩn lạc
chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt
H2O 9.7 Thời gian biến tính đầu tiên:
940C, 15 phút Lặp lại 30 chu kì: + Biến tính: 940 C, 30 giây + Gắn mồi: 600 C, 30 giây + Tổng hợp: 720 C, 60 giây
Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 6 phút
10X Taq pol Buffer 1.5
MgCl2 25 mM 0.3
dNTP 2mM 1.0
807/ 809 2 µM 0.5
Taq pol 1 u/µl 0.5
Khuôn 1.0
Tổng 15.0
(a) (b)
Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm colony PCR sàng lọc khuẩn lạc mang vùng pSFV cải biến. (a) Làn 1-6: sàng lọc khuẩn lạc mang vector pSFV-M7; làn M: thang chuẩn 100bp; làn 7-12: sàng lọc khuẩn lạc mang vector pSFV-M8. (b) Làn M7.2 và M8.1: sản phẩm PCR dùng mồi 807/809 trên khuôn plasmit của khuẩn lạc có kí hiệu tương ứng sau khi tinh sạch; làn M: thang chuẩn 100bp
634bp
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
42
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tôi đã thu được 6/74 khuẩn lạc mang đoạn chèn cải biến cho vector pSFV-M7 (kí hiệu M7.1 đến M7.6) và 4/65 khuẩn lạc mang đoạn chèn cải biến cho vector pSFV-M8 (kí hiệu M8.1 đến M8.4).
Trong Hình 18b, sản phẩm PCR sau khi tinh sạch của mẫu M7.2 và M8.1 cho các băng rõ nét nên được chọn để giải trình tự kiểm tra trình tự vùng cải biến. Kết quả giải trình tự các dịng M7.2 và M8.1 (hình 19 và 20) cho thấy các đoạn cải biến đã được chèn thành cơng vào đúng vị trí trên pSFV cơ bản như thiết kế.
Hình 19. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
43
Hình 20. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản
3.3.1. Nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho thu thể NK1 có đầu bằng bằng
phản ứng PCR dùng Pfu DNA polymerase
Chúng tơi nhân dịng thành công cADN mã cho thụ thể NK1 từ khuôn là vector nhân dòng pJET1.2-NK1 theo điều kiện phản ứng PCR được nêu ở bảng 15.
Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA
polymerase. Làn 1: sản phẩm PCR, làn 2: thang chuẩn 1kb (Fermentas) Hình 21 cho thấy, kích thước sản phẩm điện di thu được phù hợp với kích thước lý thuyết (~1.3kb). Băng điện di thu được đặc hiệu, rõ, sáng cho thấy phân
1.3kb
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
44
đoạn cADN NK1 được nhân dòng đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩn PCR được tinh sạch bằng AccuPrep PCR Purification Kit (K- 3034-1 của Bioneer). Kết quả đo quang phổ cho thấy chỉ số OD260/280=2.1, hàm lượng ADN thu được sau khi tinh sạch là 92,49ng/µl. Như vậy, đoạn gen mã cho NK1 có nồng độ và độ tinh sạch đảm bảo để thực hiện cho các thí nghiệm kế tiếp.
Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dịng đoạn cADN mã cho thụ thể NK1
3.3.2 Mở vòng pSFV bằng SmaI
Đầu tiên, chúng tôi cắt pSFV bằng SmaI theo quy trình đã tối ưu trong Bảng 16 tạo ra vector dạng thẳng có 2 đầu bằng.
Bảng 16. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI Thành phần Thể tích Thành phần Thể tích
(µl)
Điều kiện hoạt động
ADN (4500ng/ µl) 5 Ủ: 30°C-qua đêm.
Bất hoạt: 65°C-5 phút
SmaI 4
10X Tango Buffer 5
H2O 36
Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách chuyển 7µl sản phẩm cắt sang ống nghiệm mới rồi cắt bằng enzym thứ 2 là FastDigest XhoI (có vị trí cắt cách SmaI ~2kb) theo điều kiện phản ứng mô tả trên bảng 17. Kết quả điện di trên hình 22a cho thấy chúng tôi đã thu được 2 băng ADN có kích thước tương đương 2kb và 9kb, phù hợp với kích thước các sản phẩm dự kiến theo lý thuyết là 2101bp và 9387bp, khơng cịn băng ADN có kích thước >10kb (kích
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt ADN 0.5 95˚C, 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: (95˚C-30 giây, 60˚C-30 giây, 72˚C-90 giây) 72˚C – 10 phút dNTP 2mM 5
10X Buffer với MgSO4 5
NK1 F/R 2µM 5
Pfu DNA polymerase 2.5u/ µl 1
H20 28.5
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
45
thước gốc của pSFV). Như vậy, pSFV đã được mở vòng triệt để (100%) nhờ
SmaI trong điều kiện phản ứng cắt này.
(a) (b) (c)
Hình 22. Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV đã mở vòng bằng SmaI
(a) Làn1: thang chuẩn 1kb, làn 2: pSFV đã mở vòng cắt kiểm tra bằng XhoI thang chuẩn sử dụng; (b) Làn1: thang chuẩn 1kb, làn 2: pSFV mở vòng bằng
SmaI đã tinh sạch; (c) thang chuẩn 1kb (Fermentas)
Bảng 17. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt pSFV đã mở vòng bằng XhoI
Để phản ứng nối đoạn chèn NK1 vào vector mở vòng đạt hiệu suất cao nhất, pSFV đã mở vòng được ngăn tự đóng vịng bằng enzym Alkaline Phosphatase (FastAP) theo các điều kiện được mô tả ở Bảng 18.
Sản phẩm ADN sau khi tinh sạch có chỉ số OD260/280= 2,0 và có hàm lượng ADN xấp xỉ 60 ng/ µl. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch (hình 22b) cho thấy chúng tôi đã thu hồi được pSFV mở vòng với lượng đủ lớn để thực hiện cho phản ứng nối với cADN mã NK1.
Thành phần Thể tích
(µl)
Điều kiện hoạt động
ADN 7 Ủ: 37°C-5 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút FastDigest XhoI 0.5 10X FastDigest Buffer 0.3 H2O 2.2 1 2 1 2
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
46
Bảng 18. Thành phần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vịng của pSFV
3.3.3. Nối cADN mã NK1 vào pSFV cơ bản
Sau một số thí nghiệm tái tổ hợp, chúng tơi thu được điều kiện nối cADN mã NK1 vào pSFV tối ưu là: hàm lượng pSFV và cADN NK1 tham gia 20 µl hỗn hợp phản ứng là 30 ng, tỷ lệ về hàm lượng ADN giữa vector và đoạn chèn là 1:1 với 5u T4 DNA ligase. Thông thường số khuẩn lạc tái tổ hợp thu được trên đĩa thạch LB dao động từ 300 đến 400 khuẩn lạc mỗi đĩa.
3.4 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến (pSFV- M7, pSFV- M8)
3.4.1 Thu cADN mã hóa NK1 từ vector pJET1.2-NK1
Ảnh điện di Hình 23 cho thấy chúng tơi đã thu được cADN mã cho NK1 từ pJET1.2 với 1 đầu bằng (XhoI/đoạn Klenow) và 1 đầu dính (XbaI).
(a) (b)
Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 từ pJET1.2.
(a) Làn 1: thang chuẩn 1kb (Fermentas), làn 2: pJET1.2-NK1 chưa cắt, làn 3: pJET1.2-NK1mở vòng bằng XhoI; (b) Làn 1: thang chuẩn 1kb, làn 2+3: pJET1.2-
NK1 cắt bằng XhoI và XbaI.
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
pSFV đã mở vòng 38 Ủ ở 37°C trong 15 phút. Bất hoạt ở 75°C trong 5 phút. 10X FastAP Buffer 1,2 FastAP 1u/µl 5 H2O 5,8 ~4kb ~1.3kb ~3kb 1 2 3 1 2 3
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
47
Sản phẩm điện di ADN trên hình 23b cho thấy băng điện di khá mờ. Có lẽ do sau bước tinh sạch, lượng ADN thu hồi hiệu suất thấp. Để khắc phục khó khăn này, chúng tơi đã tiến hành phản ứng cắt với thể tích lớn, rồi tiến hành điện di và thu hồi ADN từ bản gel agarose bằng kit của Thermo Scientific. Hình 24 đã cho thấy, chúng tôi đã thu được cADN NK1 với hàm lượng đủ lớn để thực hiện phản ứng ligase tiếp theo.
Hình 24. Ảnh điện di cADN mã cho NK1 (XhoI/Klenow/ XbaI) sau khi tinh
sạch. Làn 1: thang chuẩn 1kb, làn 2: cADN mã cho NK1 sau khi thơi gel Quy trình đã tối ưu về nồng độ enzym và cơ chất, thời gian ủ mẫu cho phản ứng thu đoạn chèn NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính được trình bày trong Bảng 19.
Bảng 19. Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
ADN 12 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. FastDigest XhoI. 6 10X FastDigest Buffer 4 H2O 18 Thêm: 10X Klenow Buffer 1 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. dNTP 2mM 0.8 Đoạn Klenow 2 H2O 6.2 Thêm: FastDigest XbaI 6 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. 10X FastDigest Buffer 0.4 H2O 3.6 ~1.3kb 1 2
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
48
3.4.2 Mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8
( a) (b) (c)
Hình 25. Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8.
(a) pSFV cải tiến cắt đã mở vòng cắt bằng XhoI: làn 1: pSFV-M7, làn 2: thang chuẩn1kb, làn 3:pSFV-M8; (b): thang chuẩn1kb (Fermentas);
(c) pSFV cải tiến được tạo một đầu bằng (BamHI. đoạn Klenow) và 1 đầu dính
(AvrII): làn 1: pSFV-M7, làn 2: pSFV-M8, làn 3: thang chuẩn1kb
Đầu tiên, pSFV-M7 và pSFV-M8 được cắt mở vòng bằng BamHI và kiểm tra sản phẩm phản ứng bằng enzym XhoI (cách vị trí giới hạn BamHI 3kb) theo điều kiện được nêu trên bảng 20. Ảnh điện di hình 25a cho thấy phản ứng cắt lần lượt bằng 2 enzym thu được 2 băng có kích thước khoảng 9kb và 3kb, khơng có băng kích thước trên 12kb (kích thước gốc của 2 vector cải tiến). Kết quả này cho thấy phản ứng cắt mở vòng bằng BamHI đã diễn ra hoàn toàn.
Bảng 20. Quy trình mở vịng pSFV cải biến và kiểm tra hiệu suất mở vịng Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
ADN 9 Ủ: 37°C-10 phút.
Bất hoạt: 80°C-5 phút.
FastDigest BamHI 3
10X FastDigest Buffer 3
H2O 15
Lấy 5 µl hỗn hợp trên và thêm:
10X FastDigest Buffer 0.5 Ủ: 37°C-10 phút.
Bất hoạt: 75°C-10 phút.
FastDigest XhoI 0.5
H2O 4
1 2 3 1 2 3
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
49
Ở bước tiếp theo, vector sau khi mở vòng được tạo đầu bằng bằng cách xử lý với đoạn Klenow và tạo đầu dính thứ 2 bằng AvrII rồi ngăn tự đóng vịng bằng FastAP theo các điều kiện được nêu ở bảng 21.
Bảng 21. Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến
Hình 25c cho thấy sau quá trình xử lý bằng các enzym tạo đầu bằng và đầu dính đã cho sản phẩm cuối cùng có kích thước phù hợp với lý thuyết (trên 10kb). Băng điện di rõ nét cho thấy các vector cải biến được mở vòng đủ chất lượng để tiến hành cho phản ứng nối tiếp theo.
3.4.3 Nối cADN mã NK1 vào pSFV cơ bản
Sau một số lơ thí nghiệm ligase, chúng tơi nhận thấy điều kiện ligase tối ưu khi hàm lượng pSFV cải biến được sử dụng ở nồng độ 40 ng/10µl, tỷ lệ về hàm lượng ADN giữa vector và đoạn chèn là 1:9 với 0,5u T4 DNA ligase /10µl hỗn hợp ligase. Chúng tôi đã tiến hành 3 lô biến nạp với pSFV-M7 và 1 lô biến nạp với pSFV-M8. Số khuẩn lạc thu được thường dao động quang khoảng 200 khuẩn lạc mỗi đĩa thạch chứa 20 ml môi trường LB.
Thành phần Thể tích
(µl)
Điều kiện hoạt động ADN đã mở vòng bằng BamHI 15 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. 10X Klenow Buffer 1 dNTP 2mM 0.5 Klenow 1.5 H2O 7 Thêm: FastDigest AvrlI 1.5 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt bằng phenol:chloroform 10X FastDigest Buffer 0.5 H2O 3 Thêm: 10X FastAP Buffer 1 Ủ: 37°C-15 phút. Bất hoạt: 75°C-5 phút. FastAP 1u/µl 3 H2O 6
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học