2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4 Thiết kế mồi
Hai phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5 và PerPrimer 1.1.14 được sử dụng để thiết kế và lựa chọn cặp mồi PCR tối ưu trên cơ sở đánh giá các chỉ số về tính đặc hiệu, độ bền, nhiệt năng và tính tương thích (khả năng tránh tự bắt cặp).
Cặp mồi F-N/R-N dùng để nhân dòng gen mã protein vỏ capsit từ pHelper. Riêng mồi F-N có vị trí trên pSFV cơ bản, nằm trước trình tự Flag-tag ~50 bp được dùng làm mồi xuôi cho vector pSFV trong sàng lọc khuẩn lạc.
Mồi 807 nằm trước trình tự Flag-tag 126bp trong cả hai vector pSFV-M7 và pSFV-M8. Chính vì vậy, mồi 807cũng được dùng như mồi xuôi cho hai vector pSFV cải tiến trên trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc.
Mồi 809 có trình tự trên tất cả các phiên bản pSFV, cách vị trí nhân dịng đa điểm 408bp. Chính vì vậy, mồi 809 được dùng làm mồi ngược cho tất cả các phiên bản pSFV trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc.
Các mồi được thiết kế sao cho có nhiệt độ gắn mồi gần nhau để có thể kết hợp các mồi linh hoạt tùy theo mục đích thí nghiệm.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
31
2.2.5 Khuếch đại ADN nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
Phương pháp PCR nhìn chung là đơn giản và dễ thực hiện, song để thu được kết quả tốt, cần phải có sự tối ưu các thành phần tham gia phản ứng, chu trình nhiệt và sự ổn định của các điều kiện thí nghiệm cũng như trang thiết bị chuyên dụng. Các thành phần tham gia phần ứng PCR được thiết lập dựa trên mối liên hệ của chúng với nhau trong một phản ứng tổng hợp và các thí nghiệm điều chỉnh thử nghiệm. Đối với kỹ thuật PCR, thiết lập được một chu trình nhiệt là một yếu tố quan trọng, đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử ADN cũng như việc gắn mồi và kéo dài chuỗi trong mỗi chu kỳ. Sự thay đổi yếu tố nào đó trong chu trình nhiệt có thể sẽ thu được sản phẩm PCR không như mong muốn.
Trong q trình nghiên cứu, tơi đã tiến hành 2 loại phản ứng PCR là PCR thông thường (standard PCR) và colony PCR. Phản ứng PCR thông thường được tiến hành trực tiếp trên khuôn là ADN. Colony PCR là phản ứng PCR nhằm sàng lọc nhanh khuẩn lạc có mang đoạn gen quan tâm. Khuẩn lạc được thu từ đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh phù hợp được hịa vào 10µl LB lỏng, 1 µ l hỗn hợp này được dùng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng colony PCR. Chính từ sự khác biệt này, colony PCR cần có thời gian biến tính bước đầu ở 950C dài hơn so với PCR thông thường.
2.2.6 Cắt giới hạn ADN và chống ADN tự đóng vịng
Để tạo được các đoạn chèn và các linker, mở vịng vector, tạo đầu bằng, đầu dính mong muốn, các ADN vector và mang gen mã NK1 đã được cắt bằng các enzym giới hạn phù hợp. Bảng 6 mô tả thành phần điều kiện của của một phản ứng cắt cơ bản trong thể tích 20µ l. Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hồn tồn, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm tối ưu thời gian ủ, hàm lượng ADN và nồng độ enzym.
Bảng 6. Phản ứng cắt với enzym giới hạn
Thành phần Thể tích/ lượng Điều kiện
ADN 100 ng-1 µg Hỗn hợp được ủ ở
nhiệt độ và thời gian thích hợp với từng loại enzym
10X Buffer 2 µl
Mỗi enzym giới hạn 1 µl (1-10u)
H20 Thêm đến thể tích cuối là 20µl
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
32
Các đầu dính và đầu bằng của đoạn ADN sau khi cắt giới hạn có khả năng tự nối hoặc tự đóng vịng (đối với vector) khi có ADN ligase. Phản ứng tự nối của ADN được ngăn cản bằng cách loại bỏ nhóm phosphat đầu 5’ của ADN nhờ sử dụng enzym Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific FastAP Thermosensitive, Thermo Scientific) với thành phần phản ứng và điều kiện nêu ở bảng 7.
Bảng 7. Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN
Thành phần Thể tích phản ứng Điều kiện ADN dạng thẳng 1µ g Ủ 20 phút ở 37°C. Bất hoạt 75°C trong 5 phút 10X FastAP Bufer 2 µl FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 1 µl (1u) H2O Đến 20 µl
2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit
Đoạn Klenow là đoạn lớn của ADN polymerase I, E.coli. Nó có hoạt tính 5’-3’ ADN polymerase và 3’-5’ exonuclease nhưng thiếu mất hoạt tính 5’-3’ exonuclease của ADN polymerase I. Chính vì vậy, đoạn Klenow được dùng để lấp đầy đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi.
Để tạo ra đoạn ADN sợi đơi có các trình tự mong muốn, tôi thiết kế 1 đoạn oligonucleotit dài chứa tất cả các trình tự cần thiết và một đoạn oligonucleotit ngắn (14-20 Nu) bắt cặp bổ sung với với đầu 3’ của đoạn oligonucleotit dài. Hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn sẽ là cơ chất của đoạn Klenow để tạo ra đoạn ADN sợi đôi mong muốn thông qua các phản ứng sau:
a. Phản ứng giúp gắn hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn:
• on oligonucleotit di [50 àM]: 1 àl
ã on oligonucleotit ngn [50 à M]: 1.5 àl
ã 10X buffer ca enzyme gii hn: 1 àl
ã H20: 6.5 µl
Hai sợi oligobucleotit có trình tự bổ sung sẽ liên kết với nhau bằng liên kết hidro sau khi xử lý với chu trình nhiệt: 95°C trong 5 phút, hạ xuống (Tm của mồi-5°C) trong 5 phút, cuối cùng để mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
b. Phản ứng tạo sợi ADN đôi nhờ đoạn Klenow
Thêm vào 10 µl hỗn hợp phản ứng (a) các thành phần như sau:
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
33
• 10X Klenow buffer: 2 àl
ã dNTP 2mM: 2.5 àl
ã on Klenow 2u/ àl: 2.5
ã H20: 3 àl
Ủ hỗn hợp trên 1 giờ ở 37°C và bất hoạt ở 75°C trong 20 phút.
c. Tạo linker với các đầu dính mong muốn bằng cách dùng 2 enzym giới hạn thích hợp cắt ADN sợi đơi vừa thu được.
d. Tinh sạch sản phẩm cuối cùng bằng PCR AccuPrep PCR Purification Kit® (K-3034-1 của Bioneer).
2.2.8. Phản ứng nối các đoạn ADN
Việc nối các đoạn ADN được thực hiện nhờ enzym nối T4 DNA ligase ở 16°C qua đêm trong điều kiện và các thành phẩn phản ứng được trình bày ở bảng 7. Trước khi tiến hành phản ứng, các đoạn ADN được đo OD260/280 để ước tính hàm lượng. Để có phản ứng nối tối ưu giữa đoạn chèn ADN với vector, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm với dải tỷ lệ đoạn chèn/vector từ 1:1 đến 10:1. Thành phần và điều kiện của các phản ứng nối giữa đoạn cài ADN và vector đầu dính được nêu ở bảng 8 và nối các linker được nêu ở bảng 9.
Bảng 8. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng Thành phần Thể tích phản ứng Thành phần Thể tích phản ứng
Vector dạng thẳng ~20ng
Đoạn chèn ADN Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
50% PEG 4000 Solution 1 µl T4 DNA Ligase 5 u/µl 1 µl
H2O Đến 10 µl
Bảng 9. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính Thành phần Thể tích phản ứng Thành phần Thể tích phản ứng
Vector dạng thẳng ~20ng
Đoạn chèn ADN Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
T4 DNA Ligase 1 u/µl 1 µl
H2O Đến 10 µl
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
34
Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker
Thành phần Thể tích phản ứng Điều kiện
ADN dạng thẳng 50-200 ng Ủ 1 giờ ở 22°C.
Bất hoạt 65°C trong 10 phút Linker đã phosphoryl hóa ~1µ g
10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
50% PEG 4000 Solution 1 µl
T4 DNA Ligase 1 u/µl 2 µl
H2O Đến 10 µl
2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc
Hỗn hợp nối các đoạn linker vào vector sẽ được biến nạp và tế bào E.coli
DH5α khả biến, cấy trải trên đĩa LB chứa ampicillin rồi ủ ở 37°C qua đêm. Mỗi
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh được sàng lọc nhanh bằng phản ứng clonyPCR. Khuẩn lạc có băng kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cách ni bão hịa qua đêm trong mơi trường LB bổ sung kháng sinh (100µg/ml), lắc ở 37°C qua đêm, tách plasmit. Các phân đoạn cải biến được nhân lên từ plasmit bằng phản ứng PCR và giải trình tự ở Cơng ty Cổ phần Dịch vụ Phân tích Di truyền (Hà Nội, Việt Nam).
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
35
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp
Vì lượng plasmit của hệ vector SFV cơ bản chúng tôi nhận được với một lượng rất nhỏ (~5µl), để đảm bảo biến nạp plasmit với hiệu suất cao nhất và tránh bị mất vector nên chúng tôi đã thực hiện xác định quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp với hiệu suất cao nhất trong điều kiện thí nghiệm và trang thiết bị hiện tại.
Sau khi thử nghiệm các quy trình chuẩn bị tế bào khả biến khác nhau, tơi nhận thấy quy trình chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2 có thao tác và hóa chất đơn giản, nhanh gọn hơn phương pháp của Hanahan. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn khi chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2 là lắc ở 37°C, dễ áp dụng tromg điều kiện phịng thí nghiệm hơn phương pháp Inoue (nuôi cấy ở 18°C kết hợp lắc). Chính vì vậy, chúng tơi quyết định chuẩn bị tế bào khả biến sử dụng CaCl2. Trong q trình ni cấy vi khuẩn, dựa vào chỉ số O.D600 chúng tôi đã xây dựng được đường cong sinh trưởng thực tế của E.coli trong điều kiện ni cấy của phịng thí nghiệm chúng tơi (xem Hình 13). Chúng tơi cũng nhận thấy khi O.D600 = 0.35 bắt đầu thu khuẩn, tế bào sẽ có tần số biến nạp rất cao và thời gian để dung dịch nuôi cấy đạt mức O.D này càng ngắn thì tần số biến nạp càng tăng. Bảng 11 cho thấy kết quả biến nạp của 3 lô tế bào khả biến có thời gian nuôi cấy đạt O.D600 = 0.35 khác nhau. Hiệu suất biến nạp được đánh giá dựa trên số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin/ lượng plasmit dùng để biến nạp (µg).
Hình 13. Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
36
Bảng 11. Tần số biến nạp của một số lô tế bào khả biến
Áp dụng quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp được trình bày dưới đây, chúng tôi đã chuyển thành công tất cả các plasmit vào trong tế bào
E.coli DH5α để nhân dịng và lưu giữ.
a. Quy trình chuẩn bị tế bào khả biến
Chiều/tối ngày thứ nhất:
1. Chuyển 1 khuẩn lạc từ môi trường thạch LB vào 10ml môi trường lỏng LB. 2. Lắc dịch ni vi khuẩn ở 37oC qua đêm (180 vịng/phút).
Ngày thứ hai:
3. Chuyển 1 ml dịch nuôi từ bước 2 vào 50ml môi trường LB lỏng.
4. Nuôi lắc ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,3 – 0,4 (khoảng 90 - 120 phút). 5. Chuyển dịch nuôi vào 2 ống ly tâm, mỗi ống chứa 25ml. Ủ trên đá 10 phút,
ly tâm ở 4oC, tốc độ 3500 vòng/phút, trong 10 phút để thu cặn.
6. Nhẹ nhàng khuếch tán cặn tế bào (cặn ly tâm) trong mỗi ống ly tâm bằng cách bổ sung 7,5ml dung dịch MgCl2-CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2). Ủ trên đá 30 phút, ly tâm ở 4oC, 3500 vòng/phút, trong 10 phút để thu cặn. 7. Khuếch tán cặn tế bào trong ống ly tâm bằng bổ sung 1ml CaCl2 0,1M. 8. Chia lượng dịch vi khuẩn vào các ống eppendorf mỗi ống chứa 125 µl TE và
bảo quản ở -20o C.
b) Quy trình biến nạp vào tế bào DH5α
1. Lấy tế bào khả biến và plasmit lưu trong tủ -20OC, cho tan từ từ bằng cách để trong đá ~ 15 phút.
2. Lấy 125 µl tế bào khả biến, bổ sung thêm 2.5µl plasmit siêu xoắn (nồng độ ~30 ng/µ l), trộn đều hỗn hợp. Ủ trên đá 20 phút.
3. Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42o
C trong 90 giây.
Kết quả đo OD600 Lô 1 Lô 2 Lô 3
Sau 60 phút 0,103 0,156 0.162 Sau 80 phút 0, 175 0,271 0.278 Sau 90 phút 0.357 Sao 95phút 0,209 0,331 Sau 115 phút 0,271 0,356 Sau 125 phút 0,345 Số khuẩn lạc mọc 25 2320 3504
Hiệu suất biến nạp (số khuẩn lạc/µg plasmit) 4175 ~387400 ~585000
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
37
4. Nhanh chóng chuyển các ống nghiệm vào đá trong 2 phút.
5. Thêm 500µl mơi trường LB (đã ủ ở 37°C ít nhất 1 giờ) cho mỗi ống, lắc đều hỗn hợp. Ủ hỗn hợp ở 37°C trong 25 phút. Ủ hỗn hợp ở 37°C kết hợp lắc nhẹ (50 vòng/phút hoặc thấp hơn) trong 25 phút.
6. Cấy 50 µl hỗn hợp biến nạp lên đĩa LB đã bổ sung ampicilin (nồng độ cuối là 100µg/ml). Khuẩn lạc biến nạp có thể xuất hiện sau 12-16 giờ.
3.2 Cải tiến vector pSFV
3.2.1. Khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV (đoạn chèn 1)
Đoạn gen mã vỏ capsit của SFV (gồm 267 axit amin; vị trí 1-267) dài 896 bp được khuếch đại với khuôn pHelper và cặp mồi F-N/R-N có chứa trình tự nhận biết của XmaI. Trình tự sản phẩm lý thuyết dự kiến như sau:
GACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACACAGAATTCTGATTATAGCGCAC EcoRI TATTATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGG Mã mở đầu CCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCA GCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAA CCAAAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGC AGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCAT GAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGAAAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTG GGCGACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAAGGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGCTAGCTT TCAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGAGGTCGGATGCCTCAAA GTACACGCATGAGAAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACGGGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGG TTCACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAGACAGTGGCCGGCCCATCTTTG°ACAACAAGGGGAGG GTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGGCCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCGGTGGTCACCTGGAACA AAGATATGGTGACTAGAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGTCCTCCCGGGCCT
Mã axit amin 267 XmaI
Trong nghiên cứu này, các thành phần phản ứng PCR được thiết lập dựa trên mối tương tác của chúng với nhau trong một phản ứng tổng hợp và các điều kiện thí nghiệm được thử nghiệm. Ở nhiệt độ gắn mồi (Tm =) 54oC, thành phần và điều kiện của phản ứng PCR như trình bày trong bảng 12, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose cho một băng đặc hiệu, rõ và sáng có kích thước xấp xỉ 900 bp (hình 14), phù hợp với kích thước lý thuyết là 896bp. Như vậy, tơi đã nhân lên thành công đoạn gen mã hóa cho vỏ capsit của SFV với đủ chất lượng để phục vụ cho các phản ứng tiếp theo.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
38
(a) (b)
Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã vỏ capsit của SFV
(a) Ảnh điện di: M-thang chuẩn 1kb, (-)-đối chứng âm, C- sản phẩm PCR (b) Kích thước thang chuẩn 1kb (M, Fermentas)
Bảng 12. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR
khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt
H2O 19.2 Thời gian biến tính đầu tiên:
940C, 5 phút Lặp lại 45 chu kì: + Biến tính: 940 C, 30 giây + Gắn mồi: 540 C, 30 giây + Tổng hợp: 720 C, 90 giây
Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
10X Taq pol Buffer 3.0
MgCl2 25 mM 0.8
dNTP 2mM 2.0
F-N/ R-N 2 µM 1.0
Taq pol 1 u/µl 1.0
ADN 2.0
Tổng 30.0
Để đảm bảo đoạn gen được nhân lên có đoạn trình tự có khả năng tăng cường dịch mã (102 Nu đầu tiên trong khung đọc mở mã hóa cho vỏ capsit), trước khi xử lý enzym để thu đoạn chèn 1, sản phẩm PCR được tinh sạch và đem đi giải trình tự. Kết quả giải trình tự (Hình 15) cho thấy đoạn gen nhân lên có một sai khác so với trình tự khn pHelper: thay T bằng C ở vị trí 132 tương ứng với sự thay đổi bộ ba mã hóa CCT thành CCC. Tuy nhiên, hai bộ ba mã hòa này đều mã hóa cho Prolin nên thay đổi nucleotit trên khơng làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của của protein mà nó mã hóa.
M (-) C
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
39
Hình 15. Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại
đoạn gen mã vỏ capsit của SFV
3.2.2 Thu đoạn chèn số 2
Khơng thể gắn trực tiếp đoạn chèn 1 có đầu dính EcoRI/ XmaI vào pSFV vì pSFV có 4 vị trí cắt của EcoRI. Chính vì vậy, chúng tôi thiết kế một đoạn chèn thứ 2 có 2 đầu dính BglII/EcoRI gắn trước đoạn chèn 1, làm đoạn trung gian giúp nối đoạn chèn 1 vào vector pSFV cơ bản mở vòng bằng BglII/XmaI. Đoạn chèn số 2 được thu từ pHelper bằng phản ứng cắt phối hợp nhiều enzym