2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.8 Phản ứng nối các đoạn ADN
Việc nối các đoạn ADN được thực hiện nhờ enzym nối T4 DNA ligase ở 16°C qua đêm trong điều kiện và các thành phẩn phản ứng được trình bày ở bảng 7. Trước khi tiến hành phản ứng, các đoạn ADN được đo OD260/280 để ước tính hàm lượng. Để có phản ứng nối tối ưu giữa đoạn chèn ADN với vector, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với dải tỷ lệ đoạn chèn/vector từ 1:1 đến 10:1. Thành phần và điều kiện của các phản ứng nối giữa đoạn cài ADN và vector đầu dính được nêu ở bảng 8 và nối các linker được nêu ở bảng 9.
Bảng 8. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng Thành phần Thể tích phản ứng Thành phần Thể tích phản ứng
Vector dạng thẳng ~20ng
Đoạn chèn ADN Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
50% PEG 4000 Solution 1 µl T4 DNA Ligase 5 u/µl 1 µl
H2O Đến 10 µl
Bảng 9. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính Thành phần Thể tích phản ứng Thành phần Thể tích phản ứng
Vector dạng thẳng ~20ng
Đoạn chèn ADN Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
T4 DNA Ligase 1 u/µl 1 µl
H2O Đến 10 µl
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
34
Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker
Thành phần Thể tích phản ứng Điều kiện
ADN dạng thẳng 50-200 ng Ủ 1 giờ ở 22°C.
Bất hoạt 65°C trong 10 phút Linker đã phosphoryl hóa ~1µ g
10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
50% PEG 4000 Solution 1 µl
T4 DNA Ligase 1 u/µl 2 µl
H2O Đến 10 µl