3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản
3.3.1. Nhân dịng đoạn cADN mã hóa cho thu thể NK1 có đầu bằng bằng
phản ứng PCR dùng Pfu DNA polymerase
Chúng tơi nhân dịng thành công cADN mã cho thụ thể NK1 từ khn là vector nhân dịng pJET1.2-NK1 theo điều kiện phản ứng PCR được nêu ở bảng 15.
Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA
polymerase. Làn 1: sản phẩm PCR, làn 2: thang chuẩn 1kb (Fermentas) Hình 21 cho thấy, kích thước sản phẩm điện di thu được phù hợp với kích thước lý thuyết (~1.3kb). Băng điện di thu được đặc hiệu, rõ, sáng cho thấy phân
1.3kb
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
44
đoạn cADN NK1 được nhân dòng đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩn PCR được tinh sạch bằng AccuPrep PCR Purification Kit (K- 3034-1 của Bioneer). Kết quả đo quang phổ cho thấy chỉ số OD260/280=2.1, hàm lượng ADN thu được sau khi tinh sạch là 92,49ng/µl. Như vậy, đoạn gen mã cho NK1 có nồng độ và độ tinh sạch đảm bảo để thực hiện cho các thí nghiệm kế tiếp.
Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã cho thụ thể NK1
3.3.2 Mở vịng pSFV bằng SmaI
Đầu tiên, chúng tơi cắt pSFV bằng SmaI theo quy trình đã tối ưu trong Bảng 16 tạo ra vector dạng thẳng có 2 đầu bằng.
Bảng 16. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI Thành phần Thể tích Thành phần Thể tích
(µl)
Điều kiện hoạt động
ADN (4500ng/ µl) 5 Ủ: 30°C-qua đêm.
Bất hoạt: 65°C-5 phút
SmaI 4
10X Tango Buffer 5
H2O 36
Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách chuyển 7µl sản phẩm cắt sang ống nghiệm mới rồi cắt bằng enzym thứ 2 là FastDigest XhoI (có vị trí cắt cách SmaI ~2kb) theo điều kiện phản ứng mô tả trên bảng 17. Kết quả điện di trên hình 22a cho thấy chúng tôi đã thu được 2 băng ADN có kích thước tương đương 2kb và 9kb, phù hợp với kích thước các sản phẩm dự kiến theo lý thuyết là 2101bp và 9387bp, khơng cịn băng ADN có kích thước >10kb (kích
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt ADN 0.5 95˚C, 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: (95˚C-30 giây, 60˚C-30 giây, 72˚C-90 giây) 72˚C – 10 phút dNTP 2mM 5
10X Buffer với MgSO4 5
NK1 F/R 2µM 5
Pfu DNA polymerase 2.5u/ µl 1
H20 28.5
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
45
thước gốc của pSFV). Như vậy, pSFV đã được mở vòng triệt để (100%) nhờ
SmaI trong điều kiện phản ứng cắt này.
(a) (b) (c)