Bảng 5. Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu Tên Tên mồi Trình tự (5’-3’) Mục đích O-M1 AGCGAGATCTTGACTACAAGGACGACGAT BglII GACAAGCACCACCATCATCACCACCATCA CCATCACAGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTG GG TCTGGATCCTA BamHI
Tạo linker chứa trình tự của Flag-tag, His- tag, vị trí Thrombin (gọi là đoạn O-M6)
M1- M6 ATCAGGATCCAGACCCA O-M2 ATTGGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAA BamHI TCGATGCATCCTAGGGCCCGGGCGC XmaI
Tạo ra linker chứa vùng nhân dòng đa điểm cải tiến O-M7 M2-
M7
GCGCCCGGGCCCTAGGATGCATCGA
O-M3 GATCGGATCCGC Tạo linker M3-M4
O-M4 TTAGCGGATCC
(Màu xám: đoạn chứa trình tự của Flag-tag, màu vàng: đoạn chứa trình tự của His10-tag, màu hồng: đoạn chứa trình tự của Thrombin)
Hình 9. Trình tự vị trí nhân dịng đa điểm của đoạn O-M7
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
26
2.1.4 Các nhóm hóa chất chính được sử dụng
- Nhóm hóa chất cải biến vector SFV gồm có: các hóa chất sử dụng trong phản ứng nhân bản gen cần phân tích (PCR) như đệm, dNTP, MgCl2, các
polymerase, mồi đặc hiệu, các enzym giới hạn và đệm tương ứng với các enzym. - Nhóm hóa chất chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp plasmit vào tế bào DH5α gồm dung dịch CaCl2 0.1M, dung dịch MgCl2 2M, dung dịch MgCl2- CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2), dung dịch Glucosse 1M, dung dịch KCl 250 mM, môi trường LB lỏng để tăng trưởng chủng ban đầu, kháng sinh thích hợp (ampicillin), mơi trường SOC.
- Nhóm các hóa chất tách plasmit gồm Sol I ( glucose 50 mM; đệm Tris- HCl, 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM); Sol II (NaOH 0,2N, 1% SDS); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml, CH3COOH băng: 11,5 ml, H2O: 28,5 ml, Rnase 10 mg/ml không chứa DNase). Phenol: chloroform: isoamylalcohol được trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thể tích, trong đó phenol có pH 8.0; ethanol; đệm TE (10 mM Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 có chứa EDTA 1mM); isopropanol; dung dịch axetate kali 5M.
- Nhóm hóa chất cho phản ứng cắt – nối ADN được cung cấp bởi Fermentas gồm các enzyme giới hạn FastDigest, T4 DNA ligase, FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase (FTAP), đoạn Klenow.
- Nhóm các hóa chất điện di gồm agarose, đệm TAE, ethidium bromide, thang chuẩn ADN.
- Kit tinh sạch sản phẩm PCR gồm AccuPrep PCR Purification Kit (K- 3034-1 của Bioneer), Kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas).
Các hoá chất đều đảm bảo độ tinh sạch và được cung cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới: Bioneer (Hàn Quốc), Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức), IDP (Mỹ), Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ),…
2.1.5 Trang thiết bị nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện bằng các trang thiết bị, máy móc phục vụ nghiên cứu sinh học phân tử - tế bào tại Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein và Phịng thí nghiệm Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
27
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chúng tôi tiến hành xây dựng 2 vector cải biến là pSFV-M7 và pSFV-M8 từ vector cơ bản là pSFV. Hai vector cải biến sẽ có thêm đoạn tăng cường dịch mã (gen mã hóa vỏ capsit của SFV), FLAG-tag, HIS10-tag, vị trí Thrombin, vùng nhân dịng đa điểm được thiết kế thêm các vị trí enzym cắt mới theo sơ đồ thí nghiệm hình 10. cADN mã gen NK1 được cài vào các vector pSFV theo các bước trong hình 11, 12.
Hình 10. Sơ đồ nghiên cứu tạo vector cải tiến pSFV-M7 và pSFV-M8
Hình 11. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong
vector pSFV cải tiến
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
28
Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong
vector pSFV cơ bản
Các nội dung nghiên cứu được tiến hành dựa vào các phương pháp được nêu bên dưới.
2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp
Chúng tôi nhận được hệ vector SFV cơ bản (pSFV, pHelper) với một lượng rất nhỏ (~5µ l), lượng ADN này chỉ đủ cho 1-2 lần biến nạp nên một trong những nội dung nghiên cứu chúng tơi được u cầu là xây dựng quy trình chuẩn bị tế bào DH5α khả biến và biến nạp với hiệu suất cao nhât.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu dựa trên các quy trình được trình bày trong cuốn Molecular Cloning- A Laboratory manual[45], gồm:
- Quy trình chuẩn bị và biến nạp các tế bào khả biến E.coli sử dụng Calcium Chloride.
- Phương pháp Inoue để chuẩn bị và biến nạp các tế bào khả biến E.coli: tế bào “siêu-khả biến”.
- Chuẩn bị tế bảo khả biến E.coli và biến nạp theo phương pháp của Hanahan.
Số liệu được tính tốn và xử lý để đánh giá kết quả thí nghiệm: - Chỉ số OD 600 giúp xác định sự tăng trưởng của dịch nuôi cấy.
- Hiệu quả biến nạp được tính là tổng số khuẩn lạc biến nạp ứng với mỗi µg plasmit ADN siêu xoắn. Hiệu suất biến nạp mong muốn 5x106 đến 2x 107 khuẩn lạc biến nạp/ µg plasmit ADN siêu xoắn.
Từ các kết quả thu được, tìm ra quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp tối ưu.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
29
2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit
ADN plasmit được tách chiết theo quy trình của Sambrook và cs [45] gồm các bước sau:
Chiều /tối ngày thứ nhất:
Chuyển 1 khuẩn lạc đơn lẻ trên đĩa thạch vào bình tam giác chứa 10ml
LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Ủ bình ni cấy ở 37oC và lắc qua đêm. Ngày thứ hai:
1. Ly tâm 30 giây thu cặn tế bào.
2. Thêm 200 µl Sol I, hồ kết tủa và giữ hỗn hợp 5 phút ở nhiệt độ phịng. 3. Thêm 400 µl Sol II, ủ trên đá 3 phút.
4. Thêm 300 µl Sol III, ủ hỗn hợp trên đá 5 phút.
5. Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 10 phút. Chuyển 700 µl dịch nổi sang ống mới.
6. Thêm 13 µl RNase (1mg/ml) vào dịch nổi để đạt đến nồng độ cuối cùng 20 µg/ml, ủ ở 37˚C trong 20 phút.
7. Thêm thể tích tương đương hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (tỷ lệ 25:24:1 về thể tích), trộn đều, sau đó ly tâm ở 4o
C, 14000 vòng/phút, trong 5 phút để thu pha trên.
8. Bổ sung 600 µl isopropanol, trộn nhiều lần, giữ ở nhiệt độ phòng 20 phút. Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 10 phút để thu tủa.
9. Bổ sung 1 ml ethanol 70% để lạnh, ly tâm ở 4o
C, 14000 vịng/phút, trong 5 phút. Làm khơ mẫu và hồ tan tủa trong 50 µl đệm TE. Mẫu ADN thu được có thể bảo quản ở 4oC trong thời gian vài ngày hoặc bảo quản lâu dài ở - 20oC cho đến khi được dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dịng dịng
Trong q trình phân lập và nhân dòng, các vector được đưa vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α để lưu giữ và nhân dịng. Chúng tơi bảo quản các dòng vi khuẩn theo 2 cách: giữ trong các đĩa LB đặc (mơi trường thạch có agar) ở 4o
C và trong các ống LB lỏng (khơng có agar) được bổ sung thêm glycerol ở -250
C.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
30
Phương pháp bảo quản mẫu giống trong môi trường thạch: Vi khuẩn
được cấy theo kiểu zic zắc trên môi trường thạch LB và ủ qua đêm ở 37oC, rồi được lưu giữ ở 4oC. Cứ sau 14 ngày, quy trình cấy chuyển được lặp lại để giữ giống.
Phương pháp bảo quản mẫu trong môi trường lỏng gồm các bước sau:
1. Chuyển 500µl dịch vi khuẩn vào ống eppendorf, thêm 250 µ l glycerol 60% (đã khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1atm trong 20 phút). 2. Lắc vortex dung dịch để glycerol khuếch tán đều.
3. Đông lạnh nhanh dung dịch bằng nitơ lỏng. Có thể bảo quản mẫu giống đông lạnh trong thời giàn dài ở -70oC hoặc trong vài tháng ở - 25oC.
4. Để thu vi khuẩn, cào nhẹ lớp bề mặt môi trường đông lạnh với que cấy đầu tròn đã khử trùng rồi cấy sang mơi trường LB thích hợp.
2.2.4 Thiết kế mồi
Hai phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5 và PerPrimer 1.1.14 được sử dụng để thiết kế và lựa chọn cặp mồi PCR tối ưu trên cơ sở đánh giá các chỉ số về tính đặc hiệu, độ bền, nhiệt năng và tính tương thích (khả năng tránh tự bắt cặp).
Cặp mồi F-N/R-N dùng để nhân dòng gen mã protein vỏ capsit từ pHelper. Riêng mồi F-N có vị trí trên pSFV cơ bản, nằm trước trình tự Flag-tag ~50 bp được dùng làm mồi xuôi cho vector pSFV trong sàng lọc khuẩn lạc.
Mồi 807 nằm trước trình tự Flag-tag 126bp trong cả hai vector pSFV-M7 và pSFV-M8. Chính vì vậy, mồi 807cũng được dùng như mồi xuôi cho hai vector pSFV cải tiến trên trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc.
Mồi 809 có trình tự trên tất cả các phiên bản pSFV, cách vị trí nhân dịng đa điểm 408bp. Chính vì vậy, mồi 809 được dùng làm mồi ngược cho tất cả các phiên bản pSFV trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc.
Các mồi được thiết kế sao cho có nhiệt độ gắn mồi gần nhau để có thể kết hợp các mồi linh hoạt tùy theo mục đích thí nghiệm.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
31
2.2.5 Khuếch đại ADN nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
Phương pháp PCR nhìn chung là đơn giản và dễ thực hiện, song để thu được kết quả tốt, cần phải có sự tối ưu các thành phần tham gia phản ứng, chu trình nhiệt và sự ổn định của các điều kiện thí nghiệm cũng như trang thiết bị chuyên dụng. Các thành phần tham gia phần ứng PCR được thiết lập dựa trên mối liên hệ của chúng với nhau trong một phản ứng tổng hợp và các thí nghiệm điều chỉnh thử nghiệm. Đối với kỹ thuật PCR, thiết lập được một chu trình nhiệt là một yếu tố quan trọng, đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử ADN cũng như việc gắn mồi và kéo dài chuỗi trong mỗi chu kỳ. Sự thay đổi yếu tố nào đó trong chu trình nhiệt có thể sẽ thu được sản phẩm PCR không như mong muốn.
Trong q trình nghiên cứu, tơi đã tiến hành 2 loại phản ứng PCR là PCR thông thường (standard PCR) và colony PCR. Phản ứng PCR thông thường được tiến hành trực tiếp trên khuôn là ADN. Colony PCR là phản ứng PCR nhằm sàng lọc nhanh khuẩn lạc có mang đoạn gen quan tâm. Khuẩn lạc được thu từ đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh phù hợp được hịa vào 10µl LB lỏng, 1 µ l hỗn hợp này được dùng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng colony PCR. Chính từ sự khác biệt này, colony PCR cần có thời gian biến tính bước đầu ở 950C dài hơn so với PCR thông thường.
2.2.6 Cắt giới hạn ADN và chống ADN tự đóng vịng
Để tạo được các đoạn chèn và các linker, mở vịng vector, tạo đầu bằng, đầu dính mong muốn, các ADN vector và mang gen mã NK1 đã được cắt bằng các enzym giới hạn phù hợp. Bảng 6 mô tả thành phần điều kiện của của một phản ứng cắt cơ bản trong thể tích 20µ l. Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hồn tồn, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm tối ưu thời gian ủ, hàm lượng ADN và nồng độ enzym.
Bảng 6. Phản ứng cắt với enzym giới hạn
Thành phần Thể tích/ lượng Điều kiện
ADN 100 ng-1 µg Hỗn hợp được ủ ở
nhiệt độ và thời gian thích hợp với từng loại enzym
10X Buffer 2 µl
Mỗi enzym giới hạn 1 µl (1-10u)
H20 Thêm đến thể tích cuối là 20µl
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
32
Các đầu dính và đầu bằng của đoạn ADN sau khi cắt giới hạn có khả năng tự nối hoặc tự đóng vịng (đối với vector) khi có ADN ligase. Phản ứng tự nối của ADN được ngăn cản bằng cách loại bỏ nhóm phosphat đầu 5’ của ADN nhờ sử dụng enzym Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific FastAP Thermosensitive, Thermo Scientific) với thành phần phản ứng và điều kiện nêu ở bảng 7.
Bảng 7. Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN
Thành phần Thể tích phản ứng Điều kiện ADN dạng thẳng 1µ g Ủ 20 phút ở 37°C. Bất hoạt 75°C trong 5 phút 10X FastAP Bufer 2 µl FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 1 µl (1u) H2O Đến 20 µl
2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit
Đoạn Klenow là đoạn lớn của ADN polymerase I, E.coli. Nó có hoạt tính 5’-3’ ADN polymerase và 3’-5’ exonuclease nhưng thiếu mất hoạt tính 5’-3’ exonuclease của ADN polymerase I. Chính vì vậy, đoạn Klenow được dùng để lấp đầy đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi.
Để tạo ra đoạn ADN sợi đơi có các trình tự mong muốn, tôi thiết kế 1 đoạn oligonucleotit dài chứa tất cả các trình tự cần thiết và một đoạn oligonucleotit ngắn (14-20 Nu) bắt cặp bổ sung với với đầu 3’ của đoạn oligonucleotit dài. Hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn sẽ là cơ chất của đoạn Klenow để tạo ra đoạn ADN sợi đôi mong muốn thông qua các phản ứng sau:
a. Phản ứng giúp gắn hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn:
• on oligonucleotit di [50 àM]: 1 àl
ã on oligonucleotit ngn [50 à M]: 1.5 àl
ã 10X buffer ca enzyme gii hn: 1 àl
ã H20: 6.5 µl
Hai sợi oligobucleotit có trình tự bổ sung sẽ liên kết với nhau bằng liên kết hidro sau khi xử lý với chu trình nhiệt: 95°C trong 5 phút, hạ xuống (Tm của mồi-5°C) trong 5 phút, cuối cùng để mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
b. Phản ứng tạo sợi ADN đôi nhờ đoạn Klenow
Thêm vào 10 µl hỗn hợp phản ứng (a) các thành phần như sau:
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
33
• 10X Klenow buffer: 2 àl
ã dNTP 2mM: 2.5 àl
ã on Klenow 2u/ àl: 2.5
ã H20: 3 àl
Ủ hỗn hợp trên 1 giờ ở 37°C và bất hoạt ở 75°C trong 20 phút.
c. Tạo linker với các đầu dính mong muốn bằng cách dùng 2 enzym giới hạn thích hợp cắt ADN sợi đơi vừa thu được.
d. Tinh sạch sản phẩm cuối cùng bằng PCR AccuPrep PCR Purification Kit® (K-3034-1 của Bioneer).
2.2.8. Phản ứng nối các đoạn ADN
Việc nối các đoạn ADN được thực hiện nhờ enzym nối T4 DNA ligase ở 16°C qua đêm trong điều kiện và các thành phẩn phản ứng được trình bày ở bảng 7. Trước khi tiến hành phản ứng, các đoạn ADN được đo OD260/280 để ước tính hàm lượng. Để có phản ứng nối tối ưu giữa đoạn chèn ADN với vector, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm với dải tỷ lệ đoạn chèn/vector từ 1:1 đến 10:1. Thành phần và điều kiện của các phản ứng nối giữa đoạn cài ADN và vector đầu dính được nêu ở bảng 8 và nối các linker được nêu ở bảng 9.
Bảng 8. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng Thành phần Thể tích phản ứng Thành phần Thể tích phản ứng
Vector dạng thẳng ~20ng
Đoạn chèn ADN Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
50% PEG 4000 Solution 1 µl T4 DNA Ligase 5 u/µl 1 µl
H2O Đến 10 µl
Bảng 9. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính Thành phần Thể tích phản ứng Thành phần Thể tích phản ứng
Vector dạng thẳng ~20ng
Đoạn chèn ADN Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
T4 DNA Ligase 1 u/µl 1 µl
H2O Đến 10 µl
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
34
Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker
Thành phần Thể tích phản ứng Điều kiện
ADN dạng thẳng 50-200 ng Ủ 1 giờ ở 22°C.
Bất hoạt 65°C trong 10 phút Linker đã phosphoryl hóa ~1µ g
10X T4 DNA Ligase Bufer 1 µl
50% PEG 4000 Solution 1 µl
T4 DNA Ligase 1 u/µl 2 µl
H2O Đến 10 µl
2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc
Hỗn hợp nối các đoạn linker vào vector sẽ được biến nạp và tế bào E.coli
DH5α khả biến, cấy trải trên đĩa LB chứa ampicillin rồi ủ ở 37°C qua đêm. Mỗi
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh được sàng lọc nhanh bằng