(a) Làn 1: thang chuẩn 1kb (Fermentas), làn 2: pJET1.2-NK1 chưa cắt, làn 3: pJET1.2-NK1mở vòng bằng XhoI; (b) Làn 1: thang chuẩn 1kb, làn 2+3: pJET1.2-
NK1 cắt bằng XhoI và XbaI.
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
pSFV đã mở vòng 38 Ủ ở 37°C trong 15 phút. Bất hoạt ở 75°C trong 5 phút. 10X FastAP Buffer 1,2 FastAP 1u/µl 5 H2O 5,8 ~4kb ~1.3kb ~3kb 1 2 3 1 2 3
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
47
Sản phẩm điện di ADN trên hình 23b cho thấy băng điện di khá mờ. Có lẽ do sau bước tinh sạch, lượng ADN thu hồi hiệu suất thấp. Để khắc phục khó khăn này, chúng tơi đã tiến hành phản ứng cắt với thể tích lớn, rồi tiến hành điện di và thu hồi ADN từ bản gel agarose bằng kit của Thermo Scientific. Hình 24 đã cho thấy, chúng tôi đã thu được cADN NK1 với hàm lượng đủ lớn để thực hiện phản ứng ligase tiếp theo.
Hình 24. Ảnh điện di cADN mã cho NK1 (XhoI/Klenow/ XbaI) sau khi tinh
sạch. Làn 1: thang chuẩn 1kb, làn 2: cADN mã cho NK1 sau khi thơi gel Quy trình đã tối ưu về nồng độ enzym và cơ chất, thời gian ủ mẫu cho phản ứng thu đoạn chèn NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính được trình bày trong Bảng 19.
Bảng 19. Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
ADN 12 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. FastDigest XhoI. 6 10X FastDigest Buffer 4 H2O 18 Thêm: 10X Klenow Buffer 1 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. dNTP 2mM 0.8 Đoạn Klenow 2 H2O 6.2 Thêm: FastDigest XbaI 6 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. 10X FastDigest Buffer 0.4 H2O 3.6 ~1.3kb 1 2
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
48
3.4.2 Mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8
( a) (b) (c)
Hình 25. Ảnh điện di mở vịng pSFV-M7 và pSFV-M8.
(a) pSFV cải tiến cắt đã mở vòng cắt bằng XhoI: làn 1: pSFV-M7, làn 2: thang chuẩn1kb, làn 3:pSFV-M8; (b): thang chuẩn1kb (Fermentas);
(c) pSFV cải tiến được tạo một đầu bằng (BamHI. đoạn Klenow) và 1 đầu dính
(AvrII): làn 1: pSFV-M7, làn 2: pSFV-M8, làn 3: thang chuẩn1kb
Đầu tiên, pSFV-M7 và pSFV-M8 được cắt mở vòng bằng BamHI và kiểm tra sản phẩm phản ứng bằng enzym XhoI (cách vị trí giới hạn BamHI 3kb) theo điều kiện được nêu trên bảng 20. Ảnh điện di hình 25a cho thấy phản ứng cắt lần lượt bằng 2 enzym thu được 2 băng có kích thước khoảng 9kb và 3kb, khơng có băng kích thước trên 12kb (kích thước gốc của 2 vector cải tiến). Kết quả này cho thấy phản ứng cắt mở vịng bằng BamHI đã diễn ra hồn tồn.
Bảng 20. Quy trình mở vịng pSFV cải biến và kiểm tra hiệu suất mở vòng Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
ADN 9 Ủ: 37°C-10 phút.
Bất hoạt: 80°C-5 phút.
FastDigest BamHI 3
10X FastDigest Buffer 3
H2O 15
Lấy 5 µl hỗn hợp trên và thêm:
10X FastDigest Buffer 0.5 Ủ: 37°C-10 phút.
Bất hoạt: 75°C-10 phút.
FastDigest XhoI 0.5
H2O 4
1 2 3 1 2 3
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
49
Ở bước tiếp theo, vector sau khi mở vòng được tạo đầu bằng bằng cách xử lý với đoạn Klenow và tạo đầu dính thứ 2 bằng AvrII rồi ngăn tự đóng vịng bằng FastAP theo các điều kiện được nêu ở bảng 21.
Bảng 21. Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến
Hình 25c cho thấy sau quá trình xử lý bằng các enzym tạo đầu bằng và đầu dính đã cho sản phẩm cuối cùng có kích thước phù hợp với lý thuyết (trên 10kb). Băng điện di rõ nét cho thấy các vector cải biến được mở vòng đủ chất lượng để tiến hành cho phản ứng nối tiếp theo.
3.4.3 Nối cADN mã NK1 vào pSFV cơ bản
Sau một số lơ thí nghiệm ligase, chúng tôi nhận thấy điều kiện ligase tối ưu khi hàm lượng pSFV cải biến được sử dụng ở nồng độ 40 ng/10µl, tỷ lệ về hàm lượng ADN giữa vector và đoạn chèn là 1:9 với 0,5u T4 DNA ligase /10µl hỗn hợp ligase. Chúng tơi đã tiến hành 3 lô biến nạp với pSFV-M7 và 1 lô biến nạp với pSFV-M8. Số khuẩn lạc thu được thường dao động quang khoảng 200 khuẩn lạc mỗi đĩa thạch chứa 20 ml môi trường LB.
Thành phần Thể tích
(µl)
Điều kiện hoạt động ADN đã mở vịng bằng BamHI 15 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. 10X Klenow Buffer 1 dNTP 2mM 0.5 Klenow 1.5 H2O 7 Thêm: FastDigest AvrlI 1.5 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt bằng phenol:chloroform 10X FastDigest Buffer 0.5 H2O 3 Thêm: 10X FastAP Buffer 1 Ủ: 37°C-15 phút. Bất hoạt: 75°C-5 phút. FastAP 1u/µl 3 H2O 6
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
50
3.5 Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1
3.5.1 Colony PCR dùng mồi NK1 F/ R1 để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp
Chỉ những đĩa LB có đĩa đối chứng âm (hỗn hợp nối chỉ có vector, khơng có đoạn chèn) khơng mọc khuẩn lạc trên mơi trường LB có bổ sung ampicillin tương ứng khơng có hiện tượng tự đóng vịng mới được dùng để sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn. Chúng tôi sử dụng phản ứng colony PCR nhân dòng đầu 5’ cADN mã cho NK1 (cặp mồi NK1 F/NK1 R1) để xác định các khuẩn lạc mang vector pSFV cơ bản được cài đoạn NK1. Đoạn khuếch đại có chiều dài 788 bp được nhân lên theo điều kiện được mô tả ở bảng 22.
Bảng 22. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xác định khuẩn
lạc tái tổ hợp pSFV-NK1
Hình 26. Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn
NK1. Làn đánh số 1-13: các mẫu khuẩn lạc, làn M: tháng chuẩn 100bp
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 26 cho thấy chúng tôi đã thu được 8/250 khuẩn lạc có khả năng mang đoạn chèn cADN-NK1. Các khuẩn lạc
Thành phần Thể tích ( µl) Chu trình nhiệt
H2O 9.7 Thời gian biến tính đầu tiên:
940C, 5 phút Lặp lại 45 chu kì: + Biến tính: 940 C, 30 giây + Gắn mồi: 600 C, 30 giây + Tổng hợp: 720 C, 90 giây
Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Đệm 10X 1.5
MgCl2 25 mM 0.3
dNTP 2mM 1.0
NK1F / NK1 R1 2 µM 0.5
Taq Polymerase 1 u/µl 0.5
Khn 1.0
Tổng 15.0
788 bp
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
51
mang đoạn chèn có thể có đoạn chèn được chèn ngược chiều hoặc xuôi chiều. Các khuẩn lạc trên được lưu lại và làm khn để tìm khuẩn lạc chứa đoạn chèn NK1 đúng chiều bằng phương pháp colony PCR dùng cặp mồi 808/809.
3.5.2 Tối ưu phản ứng colony PCR để sàng lọc khuẩn lạc mang gen mã cho NK1 đúng chiều
Cặp mồi 808/809 được dùng để xác định đoạn chèn cADN NK1 có cài đúng chiều vào vector pSFV hay không. Do đây là mồi tự thiết kế chưa xác định được nhiệt độ gắn mồi (Tm) tối ưu bằng thực nghiệm, ngồi ra vì chưa sẵn có đối chứng dương (khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 đúng chiều), vì những lý do trên, các mẫu khuẩn lạc được xác định mang đoạn chèn NK1 (thông qua colony PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1 nêu ở mục 3.5.1) đã được dùng để chạy colony PCR trong dải nhiệt độ từ 48 đến 56o
C.
Khuẩn lạc số 97 trong lô biến nạp các tế bào mang vector pSFV cơ bản chèn NK1 là mẫu xuất hiện băng ~650bp, phù hợp với kích thước băng ADN được nhân bởi cặp mồi 808/809. Chủng 97 sau đó được dùng làm đối chứng dương để thực hiện tối ưu nhiệt độ gắn mồi với cặp mồi 808/809.
Hình 27. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809
Hình 27 cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi 808/809 là 520 C. Với nhiệt độ gắn mồi tối ưu, hiện tượng âm tính giả trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc bằng clonyPCR sẽ được giảm thiểu đáng kể, tăng hiệu quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 trong các phiên bản pSFV.
650 bp
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Với kết quả bước đầu thu được từ các nghiên cứu phát triển hệ vector SFV nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể NK1, tơi rút ra một số kết luận chính như sau:
1) Đã tối ưu điều kiện chuẩn bị tế bào khả biến DH5α và biến nạp cho phép nhân dòng các vector một cách dễ dàng.
2) Đã chuyển thành công các vector SFV vào tế bào khả biến DH5α và xác lập các điều kiện tối ưu để nhân dòng và lưu giữ ổn định.
3) Đã tiến hành cải biến được hệ vector SFV cơ bản hướng tới việc biểu hiện gen mã NK1 ở tế bào động vật có vú. Hệ vector cải biến được cài thêm vùng tăng cường dịch mã, các đuôi tag hỗ trợ quá trình tinh sạch thu hồi protein tái tổ hợp, vị trí nhân dịng đa điểm được mở rộng thuận tiện cho việc chèn gen ngoại lai.
4) Đã thiết lập được quy trình kỹ thuật và điều kiện phản ứng cài cADN mã NK1 vào vector SFV cơ bản.
5) Đã thiết lập được quy trình colony PCR nhằm sàng lọc được các chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector SFV chèn gen mã hóa NK1 đúng chiều.
Kiến nghị
Trên cơ sở kết quả của nghiên cứu này, chúng tơi có một số kiến nghị như sau:
1) Tiến hành cài ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến và chọn lọc các chủng tái tổ hợp ổn định.
2) Tiến hành các nghiên cứu biểu hiện gen NK1 bởi hệ vector pSFV cơ bản và cải biến trong các dòng tế bào chủ khác nhau, và thử nghiệm sử dụng các thụ thể NK1 tái tổ hợp trong các nghiên cứu dược phẩm.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở Di truyền học phân tử và tế
bào, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội.
2. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Giáo trình
Cơng nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
4. Andersen B. and Stevens R.C. (1998), “The human D1A dopamine receptor:
heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and purification of the functional receptor”, Protein Expr Purif, 13, pp. 111–119.
5. Asselin-Paturel C., Lassau N., Guinebretiere J. M., Zhang J., Gay F., Bex F., Hallez S., Leclere J., Peronneau P., Mami-Chouaib F., and Chouaib S. (1999), “Transfer of the murine interleukin-12 gene in vivo by a Semliki Forest virus vector induces B16 tumor regression through inhibition of tumor
blood vessel formation monitored by Doppler ultrasonography”, Gene Ther.,
6, pp. 606-615.
6. Boorsma .M, Saudan .P, Pfruender .H, Bailey .Je, Schlesinger .S, Renner .Wa, and Bachmann .Mf (2003), “Alphavirus cDNA-based expression
vectors: effects of RNA transcription and nuclear export”, Biotechnol Bioeng, 81, pp. 553-562.
7. Cereghino Jl and Cregg Jm (2000), “Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev,(24), pp. 45-66.
8. Chang .J.Y (1985), “Thrombin specificity:Requirement for apolar amino
acids adja-cent to the thrombin cleavage site of polypeptide substrate”, Eur. J. Biochem, 151, pp. 217-224.
9. Cordingley.M.G., Callahan.P.L., Sardana.V.V., Garsky.V.M., and Colonno.R.J (1990), “Substrate requirements of human rhinovirus 3C
protease for peptidecleavage in vitro”, J. Biol. Chem., 265, pp. 9062-9065.
10. E. Mathilda Sjoberg and Henrik Garoff (1996), “The translation-enhancing region of the Semliki Forest virus subgenome is only functional in the virus-
infected cell”, Journal of General Virology, 77, pp. 1323--1327.
11. Federal Register 58 No. 19, Addition of Appendix DL-X to the NIH guidelines regarding Semliki Forest virus. Human Gene Therapy. 1993. p. 5.
12. Frolov. I and Schlesinger .S (1994), “Translation of Sindbis virus mRNA:
effects of sequences downstream of the initiation codon”, Journal of Virology, 68, pp. 8111-8117.
13. Frolova E., Frolov I., and Schlesinger S (1997), J. Virol, 71, pp. 248-258.
14. Frolow I. and Schlesinger S (1994), J. Virol, 68, pp. 8111-8117.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
54
15. Gerstein A.S. (2001), Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide, Wiley-Liss, Inc.
16. Giraud A., Ataman-Onal Y., Battail N., Piga N., Brand D., Mandrand B, and Verrier B. (1999), “Generation of monoclonal antibodies to native human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein by immunization of
mice with naked RNA”, J. Virol. Meth., 79, pp. 75-84.
17. Glasgow G. M., Mcgee M. M., Tarbatt C. J., Mooney D. A., Sheahan B. J., and Atkins G. J. (1998), “The Semliki Forest virus vector induces p53-
independent apoptosis”, Journal of General Virology, 79, pp. 2405-2410.
18. Gunnar Schulte, Basic Receptor Pharmacology. 2008.
19. Hassaine G., Wagner R., Kempf J., Cherouati N., Hassaine N., Prual C., Andre N., Reinhart C., Pattus F., and Lundstrom K. (2006), “Semliki Forest virus vector for overexpression of 101 G protein-coupled receptors in
mammalian host cell”, Protein Expr Purif, 45(2), pp. 343-351.
20. Hengen P. (1995), “Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia
coli”, Trends in Biochemical Sciences, 20(7), pp. 285-286.
21. Jarvis Dl and Finn Ee (1995), “Biochemical analysis of the N-glycosylation
pathway in baculovirus-infected lepidopteran insect cells”, Virology,(212),
pp. 500–511.
22. K. Terpe ((2003) ), “Overview of tag protein fusions: from molecular and
biochemical fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnol 60, pp. 523-533.
23. Kenneth H. Lundstrom and M.L. Chiu (2006), G Protein - Coupled receptors in Drug Discovery, Taylor & Francis Group.
24. Kiefer H., Vogel R., and Maier K. (2000), “Bacterial expression of G- protein-coupled receptors: prediction of expression levels from sequence”,
Receptors Channels, 7, pp. 109-119.
25. Klabunde T. and Hessler G. (2002), “Drug design strategies for targeting G-
proteincoupled receptors”, Chembiochem, 3(10), pp. 929-944.
26. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., and Bernhard F. (2004), “High level cell-free expression and
specific labeling of integral membrane proteins”, Eur J. Biochem, 271, pp.
568–580.
27. Krasemann S., Jurgens T., and Bodemer W. (1999), “Generation of monoclonal antibodies against prion proteins with an unconventional nucleic
acid-based immunization strategy”, J. Biotechnol, 73, pp. 119-129.
28. Kunji Er, Slotboom Dj, and Poolman B (2003), “Lactococcus lactis as host
for overproduction of functional membrane proteins”, Biochim Biophys Acta,(1610), pp. 97-108.
29. Kunz .D, Gerad .Np, and Gerad .C (1992), “The human leukocyte
plateletactivating factor receptor”, J Biol Chem, 267, pp. 9101-9106.
30. Lee S. B. and Esteban M. (1994), “The interferon-induced doublestranded
RNA-activated protein kinase induces apoptosis”, Virology, 199, pp. 491-
496.
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
55
31. Loll P. J. (2003), “Membrane protein structural biology: the high throughput
challenge”, J Struct Biol, 142(1), pp. 144-153.
32. Lundstrom K. (2003), “Semliki Forest virus vectors for rapid and high-level
expression of integral membrane proteins”, Biochim Biophys Acta., 1610, pp.
90-96.
33. Lundstrom K. (2009), “An overview on GPCRs and drug discovery:
structure-based drug design and structural biology on GPCRs ”, Methods Mol Biol., 552, pp. 66-51.
34. Lundstrom K., Wagner R., Reinhart C., Desmyter A., Cherouati N., et al. (2006), “Structural genomics on membrane proteins: comparison of more
than 100 GPCRs in 3 expression sytems”, Struct Funct Genomics, 7(2), pp.
77 - 91.
35. Luque T. and O’reilly D.R. (1999), “Generation of baculovirus expression
vectors”, Mol Biotechnol, 13, pp. 153-163.
36. Maa M.C., Chinsky J. M., Ramamurthy V., Martin B. D., and Kellems R. E (199), “Identification of transcription stop sites at the 59 and 39 ends of the
murine adenosine deaminase gene”, J. Biol. Chem., 265, pp. 12513-12519.
37. Madin K., Sawasaki T., Ogasawara T., and Endo Y. (2000), “A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes”,
Proc Natl Acad Sci USA, 97, pp. 559–564.
38. Massotte D. (2003), “G protein-coupled receptor overexpression with the baculovirus–insect cell system: a tool for structural and functional studies”,
Biochim Biophys Acta, 1610, pp. 77-89.
39. Mathiot C. C., Grimaud G., Garry P., Bouquety J. C., A. Mada, Daguisy A. M., and Georges A. J. (1990), “An outbreak of human Semliki Forest virus