2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc
Hỗn hợp nối các đoạn linker vào vector sẽ được biến nạp và tế bào E.coli
DH5α khả biến, cấy trải trên đĩa LB chứa ampicillin rồi ủ ở 37°C qua đêm. Mỗi
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh được sàng lọc nhanh bằng phản ứng clonyPCR. Khuẩn lạc có băng kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cách ni bão hịa qua đêm trong môi trường LB bổ sung kháng sinh (100µg/ml), lắc ở 37°C qua đêm, tách plasmit. Các phân đoạn cải biến được nhân lên từ plasmit bằng phản ứng PCR và giải trình tự ở Cơng ty Cổ phần Dịch vụ Phân tích Di truyền (Hà Nội, Việt Nam).
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
35
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp
Vì lượng plasmit của hệ vector SFV cơ bản chúng tôi nhận được với một lượng rất nhỏ (~5µl), để đảm bảo biến nạp plasmit với hiệu suất cao nhất và tránh bị mất vector nên chúng tơi đã thực hiện xác định quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp với hiệu suất cao nhất trong điều kiện thí nghiệm và trang thiết bị hiện tại.
Sau khi thử nghiệm các quy trình chuẩn bị tế bào khả biến khác nhau, tôi nhận thấy quy trình chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2 có thao tác và hóa chất đơn giản, nhanh gọn hơn phương pháp của Hanahan. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn khi chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2 là lắc ở 37°C, dễ áp dụng tromg điều kiện phịng thí nghiệm hơn phương pháp Inoue (nuôi cấy ở 18°C kết hợp lắc). Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chuẩn bị tế bào khả biến sử dụng CaCl2. Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, dựa vào chỉ số O.D600 chúng tôi đã xây dựng được đường cong sinh trưởng thực tế của E.coli trong điều kiện nuôi cấy của phịng thí nghiệm chúng tơi (xem Hình 13). Chúng tơi cũng nhận thấy khi O.D600 = 0.35 bắt đầu thu khuẩn, tế bào sẽ có tần số biến nạp rất cao và thời gian để dung dịch nuôi cấy đạt mức O.D này càng ngắn thì tần số biến nạp càng tăng. Bảng 11 cho thấy kết quả biến nạp của 3 lô tế bào khả biến có thời gian nuôi cấy đạt O.D600 = 0.35 khác nhau. Hiệu suất biến nạp được đánh giá dựa trên số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin/ lượng plasmit dùng để biến nạp (µg).
Hình 13. Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
36
Bảng 11. Tần số biến nạp của một số lô tế bào khả biến
Áp dụng quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp được trình bày dưới đây, chúng tôi đã chuyển thành công tất cả các plasmit vào trong tế bào
E.coli DH5α để nhân dòng và lưu giữ.
a. Quy trình chuẩn bị tế bào khả biến
Chiều/tối ngày thứ nhất:
1. Chuyển 1 khuẩn lạc từ môi trường thạch LB vào 10ml môi trường lỏng LB. 2. Lắc dịch nuôi vi khuẩn ở 37oC qua đêm (180 vòng/phút).
Ngày thứ hai:
3. Chuyển 1 ml dịch nuôi từ bước 2 vào 50ml môi trường LB lỏng.
4. Nuôi lắc ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,3 – 0,4 (khoảng 90 - 120 phút). 5. Chuyển dịch nuôi vào 2 ống ly tâm, mỗi ống chứa 25ml. Ủ trên đá 10 phút,
ly tâm ở 4oC, tốc độ 3500 vòng/phút, trong 10 phút để thu cặn.
6. Nhẹ nhàng khuếch tán cặn tế bào (cặn ly tâm) trong mỗi ống ly tâm bằng cách bổ sung 7,5ml dung dịch MgCl2-CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2). Ủ trên đá 30 phút, ly tâm ở 4oC, 3500 vòng/phút, trong 10 phút để thu cặn. 7. Khuếch tán cặn tế bào trong ống ly tâm bằng bổ sung 1ml CaCl2 0,1M. 8. Chia lượng dịch vi khuẩn vào các ống eppendorf mỗi ống chứa 125 µl TE và
bảo quản ở -20o C.
b) Quy trình biến nạp vào tế bào DH5α
1. Lấy tế bào khả biến và plasmit lưu trong tủ -20OC, cho tan từ từ bằng cách để trong đá ~ 15 phút.
2. Lấy 125 µl tế bào khả biến, bổ sung thêm 2.5µl plasmit siêu xoắn (nồng độ ~30 ng/µ l), trộn đều hỗn hợp. Ủ trên đá 20 phút.
3. Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42o
C trong 90 giây.
Kết quả đo OD600 Lô 1 Lô 2 Lô 3
Sau 60 phút 0,103 0,156 0.162 Sau 80 phút 0, 175 0,271 0.278 Sau 90 phút 0.357 Sao 95phút 0,209 0,331 Sau 115 phút 0,271 0,356 Sau 125 phút 0,345 Số khuẩn lạc mọc 25 2320 3504
Hiệu suất biến nạp (số khuẩn lạc/µg plasmit) 4175 ~387400 ~585000
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
37
4. Nhanh chóng chuyển các ống nghiệm vào đá trong 2 phút.
5. Thêm 500µl mơi trường LB (đã ủ ở 37°C ít nhất 1 giờ) cho mỗi ống, lắc đều hỗn hợp. Ủ hỗn hợp ở 37°C trong 25 phút. Ủ hỗn hợp ở 37°C kết hợp lắc nhẹ (50 vòng/phút hoặc thấp hơn) trong 25 phút.
6. Cấy 50 µl hỗn hợp biến nạp lên đĩa LB đã bổ sung ampicilin (nồng độ cuối là 100µg/ml). Khuẩn lạc biến nạp có thể xuất hiện sau 12-16 giờ.