(a) Làn1: thang chuẩn 1kb, làn 2: pSFV đã mở vòng cắt kiểm tra bằng XhoI thang chuẩn sử dụng; (b) Làn1: thang chuẩn 1kb, làn 2: pSFV mở vòng bằng
SmaI đã tinh sạch; (c) thang chuẩn 1kb (Fermentas)
Bảng 17. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt pSFV đã mở vòng bằng XhoI
Để phản ứng nối đoạn chèn NK1 vào vector mở vòng đạt hiệu suất cao nhất, pSFV đã mở vòng được ngăn tự đóng vịng bằng enzym Alkaline Phosphatase (FastAP) theo các điều kiện được mô tả ở Bảng 18.
Sản phẩm ADN sau khi tinh sạch có chỉ số OD260/280= 2,0 và có hàm lượng ADN xấp xỉ 60 ng/ µl. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch (hình 22b) cho thấy chúng tơi đã thu hồi được pSFV mở vòng với lượng đủ lớn để thực hiện cho phản ứng nối với cADN mã NK1.
Thành phần Thể tích
(µl)
Điều kiện hoạt động
ADN 7 Ủ: 37°C-5 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút FastDigest XhoI 0.5 10X FastDigest Buffer 0.3 H2O 2.2 1 2 1 2
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
46
Bảng 18. Thành phần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vịng của pSFV
3.3.3. Nối cADN mã NK1 vào pSFV cơ bản
Sau một số thí nghiệm tái tổ hợp, chúng tôi thu được điều kiện nối cADN mã NK1 vào pSFV tối ưu là: hàm lượng pSFV và cADN NK1 tham gia 20 µl hỗn hợp phản ứng là 30 ng, tỷ lệ về hàm lượng ADN giữa vector và đoạn chèn là 1:1 với 5u T4 DNA ligase. Thông thường số khuẩn lạc tái tổ hợp thu được trên đĩa thạch LB dao động từ 300 đến 400 khuẩn lạc mỗi đĩa.
3.4 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến (pSFV- M7, pSFV- M8)
3.4.1 Thu cADN mã hóa NK1 từ vector pJET1.2-NK1
Ảnh điện di Hình 23 cho thấy chúng tôi đã thu được cADN mã cho NK1 từ pJET1.2 với 1 đầu bằng (XhoI/đoạn Klenow) và 1 đầu dính (XbaI).
(a) (b)