Thành phần Thể tích phản ứng Điều kiện ADN dạng thẳng 1µ g Ủ 20 phút ở 37°C. Bất hoạt 75°C trong 5 phút 10X FastAP Bufer 2 µl FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 1 µl (1u) H2O Đến 20 µl
2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit
Đoạn Klenow là đoạn lớn của ADN polymerase I, E.coli. Nó có hoạt tính 5’-3’ ADN polymerase và 3’-5’ exonuclease nhưng thiếu mất hoạt tính 5’-3’ exonuclease của ADN polymerase I. Chính vì vậy, đoạn Klenow được dùng để lấp đầy đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi.
Để tạo ra đoạn ADN sợi đơi có các trình tự mong muốn, tôi thiết kế 1 đoạn oligonucleotit dài chứa tất cả các trình tự cần thiết và một đoạn oligonucleotit ngắn (14-20 Nu) bắt cặp bổ sung với với đầu 3’ của đoạn oligonucleotit dài. Hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn sẽ là cơ chất của đoạn Klenow để tạo ra đoạn ADN sợi đôi mong muốn thông qua các phản ứng sau:
a. Phản ứng giúp gắn hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn:
ã on oligonucleotit di [50 àM]: 1 àl
ã Đoạn oligonucleotit ngắn [50 µ M]: 1.5 µl
ã 10X buffer ca enzyme gii hn: 1 àl
ã H20: 6.5 µl
Hai sợi oligobucleotit có trình tự bổ sung sẽ liên kết với nhau bằng liên kết hidro sau khi xử lý với chu trình nhiệt: 95°C trong 5 phút, hạ xuống (Tm của mồi-5°C) trong 5 phút, cuối cùng để mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
b. Phản ứng tạo sợi ADN đôi nhờ đoạn Klenow
Thêm vào 10 µl hỗn hợp phản ứng (a) các thành phần như sau:
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
33
• 10X Klenow buffer: 2 àl
ã dNTP 2mM: 2.5 àl
ã on Klenow 2u/ àl: 2.5
ã H20: 3 µl
Ủ hỗn hợp trên 1 giờ ở 37°C và bất hoạt ở 75°C trong 20 phút.
c. Tạo linker với các đầu dính mong muốn bằng cách dùng 2 enzym giới hạn thích hợp cắt ADN sợi đơi vừa thu được.
d. Tinh sạch sản phẩm cuối cùng bằng PCR AccuPrep PCR Purification Kit® (K-3034-1 của Bioneer).
2.2.8. Phản ứng nối các đoạn ADN
Việc nối các đoạn ADN được thực hiện nhờ enzym nối T4 DNA ligase ở 16°C qua đêm trong điều kiện và các thành phẩn phản ứng được trình bày ở bảng 7. Trước khi tiến hành phản ứng, các đoạn ADN được đo OD260/280 để ước tính hàm lượng. Để có phản ứng nối tối ưu giữa đoạn chèn ADN với vector, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với dải tỷ lệ đoạn chèn/vector từ 1:1 đến 10:1. Thành phần và điều kiện của các phản ứng nối giữa đoạn cài ADN và vector đầu dính được nêu ở bảng 8 và nối các linker được nêu ở bảng 9.