NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu
2.1.1 Nguyên liệu
- Các chủng vi khuẩn, nấm mốc, và nấm men gây hỏng quả đƣợc sử dụng từ bộ sƣu tập giống của Phòng Cơng nghệ Sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (bảng 2.1).
Bảng 2. 1: Các chủng vi sinh vật được sử dụng của phòng CNSH
STT Các chủng vi sinh vật Nguồn gốc phân lập
1 Micrococcus loteus VK1 chủng chuẩn
2 Listonella damsela Nhãn
3 Bacillus cereus Xoài
4 Pseudomonas putida VK731 chủng chuẩn
5 S. cerevisiae Y1 chủng chuẩn
6 Rhodoturola sp. Xoài
7 Candida sp. Xoài
8 Torulopsis sp. Xoài
9 Hansenulla sp. Cam
10 Geotricum candidum Bơ
11 Valsa sp. Cam
12 Aspergillus awamohi Nhãn
13 Fusarium oxysporum M1 chủng chuẩn
14 Cladosporium tenuisimum Thanh Long
15 Aspergillus versicolor Xoài
- Hai chủng nấm da Candida albicans, Trychophytol mentargrohytes đƣợc phân lập tại khoa xét nghiệm Viện Da Liễu Trung Ƣơng.
- Nghệ Yên đƣợc mua về rửa
sạch đất, loại bỏ các phần hƣ, phơi khơ trong bóng râm.
- Cam ở huyện Bắc Quang tỉnh Hà Giang dùng để thí nghiệm cịn tƣơi, khơng có thuốc bảo quản thực vật.
2.1.2 Thiết bị, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Hóa chất dùng trong nghiên cứu: NaOH; CH3COOH; CaCl2; AgNO3; I2; H2SO4
của các hãng có uy tín trên thế giới nhƣ Merk, Biochemika…
Môi trƣờng
Bảng 2. 2: Môi trường Czapek- dox
Thành phần Hàm lƣợng (g/l) NaNO3 3 KH2PO4 1 MgSO4.H2O 0,5 KCl 0,5 FeSO4 0,01 Sacaroza 20 Agar 16 pH = 7
Bảng 2. 3: Môi trường Hansen
Thành phần Hàm lƣợng (g/l) Glucoza 50 Pepton 10 KH2PO4 3 MgSO4.7H2O 2 – 5 Agar 20 pH = 7,0
Bảng 2. 4: Môi trường MPA
Thành phần Hàm lƣợng (g/l)
Cao thịt 3
Pepton 5
Agar 17
Bảng 2. 5: Môi trường Sabouraud Thành phần Hàm lƣợng (g/l) Glucoza 40 Pepton 10 Agar 20 pH = 7 Thiết bị:
- Bộ cô quay chân không (Eyela, Nhật bản) - Hệ thống thiết bị Clevenger
- Máy GC-System HP6890 MSD 5973 Aglilent - Máy đo màu Color Meter (Tec PCM/PSM, Mỹ) - Máy khuấy từ ( RotoLab, OSI).
- Máy ly tâm ( Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ). - Máy khuấy trộn Vortex ( RotoLab, OSI). - Máy quang phổ ( Shimadzu, Nhật Bản). - Máy đo khúc xạ kế Abbemat
- Máy ổn nhiệt (IKA, Đức). - Tủ lạnh -20o
C (Frigor, Đan Mạch). - Tủ lạnh sâu -75o
C ( Sanyo, Nhật Bản). - Tủ cấy vô trùng ( Sanyo).
- Chiết quang kế (Atago, Nhật bản) - Cân phân tích (Mettler Toledo, Mỹ). - Tủ sấy (Diemos Fisherbrand)
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết tinh dầu nghệ vàng
Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp chưng cất với toluene [23].
Cân 20 gam mẫu chính xác tới 0,01 gam rồi đƣa vào bình cầu có dung tích 500ml. Thêm toluen vào ngập mẫu, xoay lắc bình sao cho mẫu phân bố đều trong dung dịch. Lắp dụng cụ xác định thủy phần với sinh hàn hồi lƣu. Đun hỗn hợp trong bình đến nhiệt độ sơi cho tới khi nƣớc ra ở dụng cụ xác định thủy phần khơng đổi. Đọc thể tích nƣớc thu đƣợc ở dụng cụ đo. Hàm lƣợng nƣớc có trong nguyên liệu đƣợc xác định theo cơng thức sau:
(%) 100 . . m d V w
Trong đó: w: Độ ẩm của nguyên liệu (%) m: Khối lƣợng của nguyên liệu (g)
V: Thể tích nƣớc thu đƣợc ở dụng cụ đo (ml) d: Tỷ trọng của nƣớc (g/ml)
Phương pháp tách chiết tinh dầu bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước
Nghệ tƣơi thu hoạch sau 9 tháng (tháng 2 đến tháng 3 âm lịch) rửa sạch
tới kích thƣớc lọt qua đƣờ mm. lấy 100
lít ọ 500ml u. Lắp sinh hàn và
bình hứng tinh dầu có chia vạch đến 0,10 ml. Thờ
ốn hơi nƣớc 8 giờ khi có dịch ngƣng chảy vào ống hứng theo dƣợc điển Việt Nam. Tinh dầu đƣợc làm khô bằng natri sulfate khan rồi giữ trong lọ kín ở nhiệt độ 4- 10oC trƣớc khi phân tích thành phần và thực hiện các nghiên cứu khác. Hàm lƣợng tinh dầu đƣợc tính theo trọng lƣợng tƣơi bằng tỷ lệ phần trăm theo thể tích tinh dầu (ml) trên trọng lƣợng mẫu tƣơi (gam).
Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng khơ theo cơng thức sau: (%) ) 100 ( 10 . . 4 w m d V X
Trong đó: X: Hàm lƣợng tinh dầu có trong nguyên liệu (%) m: Khối lƣợng nguyên liệu đem chƣng cất (g) d: Tỷ trọng của tinh dầu
V: Thể tích tinh dầu thu đƣợc ở dụng cụ đo (ml) w: Độ ẩm nguyên liệu (%).
dễ bay hơi
lấy 100g sung thêm dung môi (n-hexane và
chloroform) cho đến khi dung môi vàng/dung mơi là 1/3
(g/ml) h (200 vịng/phút) lấy phần dung mơi có chứa tinh dầu rồi đuổi dung môi ở nhiệt độ 60o
C bằng phƣơng pháp chƣng cất ở áp suất thấp (cô quay), thu lấy dịch chiết thơ. Tiến hành hịa tan dịch chiết thô bằng ethanol 96o và làm lạnh sau 2 ngày rồi lọc bỏ cặn thu đƣợc hỗn hợp dịch. Tiến hành tách ethanol ở nhiệt độ 40oC bằng phƣơng pháp chƣng cất ở áp suất thấp thu tinh dầu. Dung môi sử dụng cho phƣơng pháp này cần đƣợc lựa chọn bởi có thể cùng một loại dung mơi sẽ hồ tan cả tinh dầu và tạp chất, ít tan trong nƣớc, dễ loại khỏi tinh dầu khi tách chiết [44].
2.2.2 Phƣơng pháp tách phân đoạn tinh dầu nghệ vàng
Tinh dầu nghệ vàng đƣợc tách thành
Phƣơng pháp làm giàu các cấu tử để thu đƣợc các phân đoạn khác nhau của tinh dầu.
Hệ thống thiết bị gồm bộ cất có 2 bình thủy tinh, một sinh hàn thẳng, áp kế, một bình cất, một bình thu, bơm hút chân khơng và bộ ổn nhiệt. Tinh dầu nghệ cất lôi cuốn hơi nƣớc đƣợc cho vào bình cất 2 cổ, lắp vào hệ thống cất, các nút nhám đƣợc bôi dầu chân khơng, nƣớc sinh hàn có nhiệt độ < 20o
C [38].
2.2.3 Phƣơng pháp xác định chỉ số hóa lý và phân tích thành phần của tinh dầu nghệ vàng
2.2.3.1 Xác định các chỉ số hóa lý của tinh dầu
a. Xác định độ trong, màu sắc và mùi vị của tinh dầu theo TCVN 8460:2010 [24]
Độ trong, màu sắc và mùi vị của tinh dầu là một chỉ tiêu quan trọng trong quá trình nghiên cứu về tinh dầu. Để xác định chỉ tiêu này thƣờng sử dụng các dụng cụ và hóa chất nhƣ: Ống nghiệm thủy tinh trong suốt có đƣờng kính 20- 25mm, dung tích 10ml, cân kỹ thuật, ống hút, giấy thấm và đƣờng kính trắng.
b. Xác định tỷ trọng của tinh dầu theo TCVN 8444:2010 [24]
Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số giữa khối lƣợng của một thể tích tinh dầu xác định ở 20oC với khối lƣợng của cùng một thể tích nƣớc cất cũng ở 20oC. Tỉ trọng của tinh dầu ở 20oC đƣợc tính theo cơng thức: d= m m m m 1 2 Trong đó: m - khối lƣợng bình tỉ trọng, g; m1 - khối lƣợng bình tỉ trọng và nƣớc ở 20oC, g; m2 - khối lƣợng bình tỉ trọng và tinh dầu ở 20oC, g.
Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định liên tiếp có sai lệch giá trị khơng lớn hơn 0,001 và đƣợc làm tròn tới số thập phân thứ tƣ.
Tinh dầu thƣờng là chất có hoạt động quang học, nghĩa là có đặc tính làm quay mặt phẳng phân cực của chùm tia sáng phân cực truyền qua. Khả năng phân cực của mỗi tinh dầu khác nhau và tùy thuộc vào cấu tử của tinh dầu, độ dài sóng của ánh sáng chiếu qua, nhiệt độ lúc đo và đƣợc biểu thị bằng năng suất quay cực, ký hiệu là α. Góc quay cực đƣợc xác định ở nhiệt độ phòng.
d. Xác định chỉ số khúc xạ theo TCVN 8445:2010 [24]
Chỉ số khúc xạ là tỷ số giữa sin của góc tới với sin của góc khúc xạ. Khi một chùm tia sáng đi từ mơi trƣờng khơng khí qua mơi trƣờng tinh dầu nào đó, tia sáng sẽ bị gẫy khúc, đó là hiện tƣợng khúc xạ ánh sáng. Đối với mỗi tinh dầu tỉ số giữa sin của góc tới và sin của góc khúc xạ là một hằng số và nó cùng bằng tỉ số vận tốc ánh sáng trong mơi trƣờng khơng khí và mơi trƣờng tinh dầu. Chỉ số khúc xạ đƣợc xác định ở 20o
C, theo phƣơng pháp đo góc tới hạn bằng khúc xạ kế. Nếu đo chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ khác 20o
C hoặc 25oC thì n20D hoặc n25D đƣợc tính theo cơng thức nhƣ sau:
n20 D = nt D + (t – 20). 0,0004 Trong đó: nt D: Chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ t lúc đo t: Nhiệt độ lúc đo
0.0004: Hệ số điều chỉnh khi nhiệt độ tăng hoặc giảm 1oC
e. Xác định chỉ số axit theo TCVN 8450:2010 [24]
Cân 2gam tinh dầu vào bình cầu xà phịng hóa. Thêm vào đó 10 ml ethanol và 5 giọt chỉ thị phenolphtalein chuẩn độ bằng KOH 0,1N trong ethanol cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong khoảng 30 giây. Chỉ số axit đƣợc tính kết quả nhƣ sau:
Chỉ số axit (X1) đƣợc tính theo cơng thức:
m V X1 5,61.
Trong đó:
V – lƣợng dung dịch KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ, ml; m – khối lƣợng mẫu thử, g;
5,61 – lƣợng KOH có trong ethanol, tính bằng mg.
f. Xác định chỉ số ester theo TCVN 8451:2010 [24]
- Dùng buret cho 20 ml dung dịch KOH 0,5N vào bình cầu để xà phịng hóa có chứa lƣợng mẫu đã xác định chỉ số axit lắp ống sinh hàn khí và đun sơi nhẹ trong 1 giờ. Cùng một lúc trong bình cầu khác kiểm tra song song một mẫu trắng gồm 10 ml etanol và 20 ml
dung dịch KOH 0,5N trong cồn. Đun xong, để nguội cho cả 2 bình mỗi bình 5 giọt chỉ thị màu phenolphetalein 2% (hoặc đỏ phenol). Chuẩn độ bằng dung dịch axit sunfuric 0,5N.
Chỉ số este (X2) đƣợc tính bằng cơng thức: m V V X ( 1).28,05 2 Trong đó:
V – lƣợng dung dịch axit sunfuric 0,5N đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) V1 - lƣợng dung dịch axit sunfuric 0,5N đã dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) m – khối lƣợng mẫu, g;
28,05 – lƣợng KOH 0,5N.
2.2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu
Thành phần tinh dầu đƣợc phân tích (GC-MS) với các điều kiện nhƣ sau:
Các chất đƣợc tách bằng cột mao quản và nhận biết bằng detector chọn khối (MSD). Máy GC-System HP6890 MSD 5973 Aglilent ghép trực tiếp với máy sắc ký HP5980 Series II. Máy hoạt động theo chƣơng trình nhiệt độ: nhiệt độ 65oC giữ 2 phút, tăng nhiệt độ 5oC/phút đến 90oC giữ 3 phút, tăng 20oC /phút đến 103oC, giữ ở 103oC 3 phút, tăng nhiệt độ 8oC /phút tới 150oC, giữ ở 150oC 15 phút và tăng 20oC /phút tới 280o
C. Điều kiện MS: ion hóa mẫu ở thế ion hóa 7,10ev, nhiệt độ duy trì 250o
C, khí mang là heli tốc độ 1,0 ml/phút, tốc độ chia dòng 1:50.
Wiley [41, 44, 84, 109, 132, 145]
2.2.4 Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng
Các chủng vi sinh vật đƣợc hoạt hóa trên mơi trƣờng đặc và cấy trên môi trƣờng Czapek- Dox (cho nấm sợi), Hansen (cho nấm men), MPA cho vi khuẩn và Sabouraud nuôi cấy nấm men Candida albican và nấm mốc Trychophytol mentargrohytes . Bào tử nấm sợi và sinh khối nấm men, vi khuẩn đƣợc pha loãng trong nƣớc muối sinh lý 0,9%. Mật độ vi sinh vật khoảng 108
CFU/ml bằng phƣơng pháp so sánh độ đục với ống chuẩn 0,5 McFarland (108 CFU/ml) hoặc tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 550 nm, DO = 0,125. Để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng chúng tơi tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp [133].
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Vi sinh vật đƣợc hoạt hóa trong mơi trƣờng lỏng 24 giờ ở 30o
C.
Cấy vi sinh vật vào môi trƣờng mới có bổ sung tinh dầu với mật độ cuối cùng khoảng 106
CFU/ml. Ống đối chứng không bổ sung tinh dầu. Sau 24h, lấy 100 l mỗi chủng cấy trải lên đĩa petri có mơi trƣờng tƣơng ứng với vi sinh vật (khơng có tinh dầu). Sau 24h-36h ni cấy ở nhiệt độ 300C, đánh giá sự phát triển của vi sinh vật bằng cách xác định số lƣợng khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng đặc
Khả năng ức chế đƣợc tính theo cơng thức:
% ức chế = (1 - T/C) x 100 Trong đó : T là CFU/ml mẫu thử nghiệm
C là CFU/ml đối chứng
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các loại tinh dầu nghệ bằng đĩa giấy khuyếch tán [38, 107, 108, 133, 148]
Tinh dầu đƣợc pha lỗng các nồng độ trong dung dịch etylenglycol có bổ sung 0,1% Tween-20.
Dùng pipet lấy 20µl tinh dầu nghệ vàng có nồng độ khác nhau đƣa lên tấm giấy lọc vơ trùng có đƣờng kính 0,5cm. Các tấm giấy lọc này đƣợc đặt trên môi trƣờng đã cấy trải vi sinh vật với mật độ khoảng 108
CFU/ml và ni 24h ở 30oC. Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ mạnh hay yếu tùy thuộc vào đƣờng kính vịng kháng khuẩn lớn hay nhỏ. Sau thời gian ni cấy, tiến hành xác định đƣờng kính vịng kháng khuẩn và kết luận. Mỗi
t nhắc lại ít nhất 3
Có thể phân loại độ nhạy cảm của tinh dầu đối với vi sinh vật dựa vào kích thƣớc vịng kháng khuẩn Zanil và Junior nhƣ sau :
+ không mẫn cảm (-) : D <8 mm + mẫn cảm (+) : D = 9- 12 mm + rất mẫn cảm (++): D= 13-18 mm + cực kỳ mẫn cảm (+++): D > 18 mm
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng trên Cam
Qui trình xử lý quả trƣớc thí nghiệm: cam Hà Giang đƣợc rửa sạch bằng nƣớc. Sau
đó đƣợc tráng qua nƣớc H2O2 1% để loại bỏ các vi sinh vật bám trên vỏ quả.
- Quá trình lây nhiễm: Sử dụng nƣớc muối sinh lý 0,9% để pha loãng sinh khối nấm men thuộc chi Rhodoturola và bảo tử nấm mốc thuộc chi Valsa, Fusarium oxysporum với mật độ vi sinh vật khoảng 105
lần. Nhúng quả vào dung dịch với thời gian 5 phút để tạo điều kiện cho vi sinh vật có khả năng bám dính trên quả. Sau đó để khơ tự nhiên.
- Q trình xử lý: Nhúng quả vào tinh dầu nghệ vàng 1 phút với nồng độ 0,5% và 1%. Sau đó để khơ khoảng 20 phút rồi đặt lên khay, bảo quản quả trong hộp cacton sạch ở điều kiện nhiệt độ thƣờng (27 ± 2ºC). Theo dõi, quan sát và mô tả hiện trạng quả theo thời gian.
Hình 2. 1: Quy trình đánh giá khả năng kháng vi sinh của tinh dầu nghệ vàng trên cam
2.2.5 Xây dựng qui trình bảo quản cam Hà Giang ở quy mơ phịng thí nghiệm
Cam đƣợc thu mua tại cùng một vƣờn, ở các cây 7 tuổi, có chế độ chăm sóc tƣơng tự nhƣ nhau, thu hoạch vào thời điểm khô, mát khơng có sƣơng mù. Hái từng quả một. Sau đó xếp cam vào thùng carton có kht nhiều lỗ thơng thống, lót giấy mềm xung quanh và dƣới đáy. Lúc đặt cam vào thùng, tránh để cuống đâm vào các quả khác. Vận chuyển bằng xe về nơi bố trí thí nghiệm. Trong q trình thu hái, vận chuyển, quả không tiếp xúc trực tiếp với đất hay ánh nắng mặt trời.
- Bố trí thí nghiệm : Cam sau khi đƣa về phịng thí nghiệm đƣợc lựa chọn và phân loại, chọn những quả không bị bầm dập, xây xát, không bị chọc thủng, cuống cắt sát núm quả và loại bỏ các quả quá to hoặc quá nhỏ. Cam đủ tiêu chuẩn làm thí nghiệm sẽ đƣợc bố trí ngẫu
Mẫu đối chứng Mẫu xử lý bằng tinh dầu
Bảo quản
Đánh giá kết quả Lây nhiễm vi sinh vật
Rửa sạch Cam sau thu hoạch
nhiên theo 6 công thức. Mỗi công thức gồm 40 quả, trong đó có 20 quả đƣợc khoanh trịn và đánh số thứ tự từ 1 đến 20.
ĐC: Đối chứng khơng xử lý chế phẩm ở nhiệt độ phịng CT1: Mẫu xử lý bằng chế phẩm ở nhiệt độ phòng CT2: Mẫu xử lý bằng tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ phòng
CT3: Mẫu xử lý bằng chế phẩm + tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ phịng CT4: Đối chứng khơng xử lý chế phẩm ở nhiệt độ 8 ± 2o
C CT5: Mẫu xử lý bằng chế phẩm + tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ 8 ± 2o
C
(Thành phần chế phẩm gồm: acid stearic, acid citric, glycerol, gelatin, tween-80, CaCl2) - Toàn bộ các công thức đƣợc thực hiện trong cùng thời điểm.