2.2.5 Xây dựng qui trình bảo quản cam Hà Giang ở quy mơ phịng thí nghiệm
Cam đƣợc thu mua tại cùng một vƣờn, ở các cây 7 tuổi, có chế độ chăm sóc tƣơng tự nhƣ nhau, thu hoạch vào thời điểm khơ, mát khơng có sƣơng mù. Hái từng quả một. Sau đó xếp cam vào thùng carton có kht nhiều lỗ thơng thống, lót giấy mềm xung quanh và dƣới đáy. Lúc đặt cam vào thùng, tránh để cuống đâm vào các quả khác. Vận chuyển bằng xe về nơi bố trí thí nghiệm. Trong q trình thu hái, vận chuyển, quả khơng tiếp xúc trực tiếp với đất hay ánh nắng mặt trời.
- Bố trí thí nghiệm : Cam sau khi đƣa về phịng thí nghiệm đƣợc lựa chọn và phân loại, chọn những quả không bị bầm dập, xây xát, không bị chọc thủng, cuống cắt sát núm quả và loại bỏ các quả quá to hoặc quá nhỏ. Cam đủ tiêu chuẩn làm thí nghiệm sẽ đƣợc bố trí ngẫu
Mẫu đối chứng Mẫu xử lý bằng tinh dầu
Bảo quản
Đánh giá kết quả Lây nhiễm vi sinh vật
Rửa sạch Cam sau thu hoạch
nhiên theo 6 công thức. Mỗi công thức gồm 40 quả, trong đó có 20 quả đƣợc khoanh trịn và đánh số thứ tự từ 1 đến 20.
ĐC: Đối chứng khơng xử lý chế phẩm ở nhiệt độ phịng CT1: Mẫu xử lý bằng chế phẩm ở nhiệt độ phòng CT2: Mẫu xử lý bằng tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ phòng
CT3: Mẫu xử lý bằng chế phẩm + tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ phòng CT4: Đối chứng không xử lý chế phẩm ở nhiệt độ 8 ± 2o
C CT5: Mẫu xử lý bằng chế phẩm + tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ 8 ± 2o
C
(Thành phần chế phẩm gồm: acid stearic, acid citric, glycerol, gelatin, tween-80, CaCl2) - Tồn bộ các cơng thức đƣợc thực hiện trong cùng thời điểm.
- Tiến hành theo dõi, lấy mẫu ngẫu nhiên và phân tích định kỳ 5 ngày một lần (mỗi lô lấy mẫu ngẫu nhiên 3 điểm cho một định kỳ theo dõi).
- Thời gian bảo quản theo dõi là 30 ngày.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình bảo quản bằng chế phẩm tinh dầu nghệ vàng phẩm tinh dầu nghệ vàng
- Mẫu phân tích hóa sinh đƣợc lấy ngẫu nhiên trong số 20 quả không khoanh trịn ở các cơng thức và định kỳ 3 quả/cơng thức/lần phân tích.
- Mẫu phân tích cơ lý là 20 quả đƣợc đánh số và khoanh tròn trong từng công thức. a. Xác định tỷ lệ tổn thất khối lượng tự nhiên
Tỷ lệ tổn thất khối lƣợng đƣợc tính theo cơng thức: X(%) = [(M1-M2)/M1]x100, trong đó M1(g) là khối lƣợng quả trƣớc bảo quản và M2(g) là khối lƣợng quả sau phân tích. Tỷ lệ thối hỏng quả đƣợc tính cơng thức: X(%) = [M2:M1]x100, trong đó M1 là tổng số quả theo dõi, M2 là tổng số quả thối hỏng sau các lần kiểm tra định kỳ.
b. Xác định sự biến đổi màu sắc vỏ quả qua từng giai đoạn bằng máy đo màu Color Meter
Máy đo dựa trên nguyên tắc sự phản xạ ánh sáng từ bề mặt quả tới bộ phận quang phổ của máy. Màu sắc của quả đƣợc thể hiện thông qua các chỉ số L- a - b trong đó:
L: có giá trị từ 0 (total black - tối đen) đến +100 (pure white - trắng tinh) a: có giá trị từ - 60 (green - xanh lá cây) đến +60 (red - đỏ)
b: có giá trị từ - 60 (blue - xanh da trời) đến +60 (yellow – vàng) Độ biến đổi màu sắc của quả đƣợc xác định bằng công thức:
∆E = [(Li- Lo)2 + (ai - ao)2 + (bi - bo) 2]1/2 Trong đó:
- Lo , ao, bo là kết quả đo màu của nguyên liệu đầu vào
c. Xác định hàm lượng vitamin C (TCVN 6427 – 2: 1998)
Lấy 10ml dịch quả cho vào bình tam giác 250ml, cho 5ml dung dịch H2SO4 và thêm vài giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh. Kết quả tính theo cơng thức:
Hàm lƣợng VTM C=
V n 0,88 1000
(mg%)
Trong đó: n: số ml dung dịch I2 0,01N dùng để chuẩn độ
0,88: số mg axit ascocbic tƣơng ứng với 1ml I2 0,01N V: số ml dịch quả lấy để phân tích
d. Xác định hàm lượng đường (TCVN 3948 – 84)
Máy đo chiết quang kế cầm tay có thể sử dụng để xác định hàm lƣợng đƣờng (tƣơng đƣơng với độ Brix) trong một mẫu nhỏ dịch quả. Nhiệt độ sẽ ảnh hƣởng đến kết quả đo nên cần điều chỉnh phép đo ở nhiệt độ thƣờng. Để có kết quả chính xác hơn cần làm sạch và chuẩn hóa máy đo giữa mỗi lần đọc kết quả bằng nƣớc cất.
e. Phương pháp xác định hàm lượng axit hữu cơ tổng số (TCVN 3948 – 84)
Từ các mẫu cam phân tích ở mỗi cơng thức ép lấy dịch quả và lọc trong. Dùng pipet hút 10ml dịch quả cho vào bình tam giác, thêm 20ml nƣớc cất và 5 giọt phenolftalein 1%. Tiến hành chuẩn dộ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu phớt hồng. Hàm lƣợng axit đƣợc tính theo cơng thức:
X = (M x V2 x N x 100) / (V1 x 1000) Trong đó: X: Hàm lƣợng axit (%)
M: Phân tử lƣợng axit xitric = 64 N: Nồng độ dung dịch NaOH V1: Số ml dịch quả lấy để chuẩn độ
V2: Số ml NaOH cần để chuẩn độ
f. Phương pháp đánh giá cảm quan bằng cho điểm thị hiếu
Đánh giá cảm quan đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp cho điểm thị hiếu. Sử dụng các giác quan để đánh giá các chỉ tiêu về hình thức bên ngồi, màu vỏ quả, màu thịt quả, mùi vị thịt quả. Tất cả các chỉ tiêu đều đƣợc đánh giá theo thang điểm 5 (0-5 điểm). Đánh giá cảm quan đƣợc tiến hành nhƣ sau: chuẩn bị phiếu trả lời, chuẩn bị mẫu, mã hóa mẫu, mời đánh giá, tổng hợp kết quả. Các mẫu đánh giá là ĐC, CT1, CT2, CT3 và đƣợc mã hóa tƣơng ứng là A, B, C, D. Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 10 thành viên có cả nam và nữ, mỗi thành viên đƣợc phát một phiếu đánh giá cảm quan và các mẫu cam đã đƣợc mã
hóa, thứ tự các mẫu khi phát cho các thành viên của hội đồng là không giống nhau. Sau mỗi lần thử, các thành viên sử dụng nƣớc lọc để thanh vị trƣớc khi thử mẫu tiếp theo.
Bảng 2. 6: : Phiếu đánh giá cảm quan bằng phép thử cho điểm thị hiếu
g. Xác định độ bám dính của chế phẩm theo TCVN 2097:1993
Độ bám dính của màng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cắt. Tiến hành cắt 3 điểm khác nhau trên bề mặt quả, khoảng cách nhau 1mm. Kết hợp xác định độ bám dính của màng và đo độ dầy màng bán thấm trên bề mặt quả bằng máy NiKKO – ECLIPSE. E600, với chƣơng trình IMAGE PROPUS. Chụp ảnh trên phần mềm ACT1, Camera DXM 1200 Niko Digital camera
2.2.7. Tối ƣu hóa quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam Hà Giang bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm. quản cam Hà Giang bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm.
Bố trí thí nghiệm đƣợc thực hiện theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken, với k=3. Có 17 thí nghiệm, trong đó có 5 thí nghiệm tại tâm nhƣ sau:
Bảng 2. 7: Bố trí thí nghiệm sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam Hà Giang trong bảo quản cam Hà Giang
TN Giá trị
X1 X2 X3
1 - - 0
2 + - 0
3 - + 0
Phịng thí nghiệm phân tích cảm quan
PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN
Phép thử cho điểm thị hiếu
Họ và tên:………………… Ngày thử: ……………….
Bạn nhận đƣợc 4 mẫu ký hiệu A, B, C, D. Bạn hãy thử và định lƣợng mức độ ƣa thích, hài lịng của mình đối với sản phẩm bằng thang điểm sau:
0: khơng thể chấp nhận 1: cịn sử dụng đƣợc 2: mức độ trung bình 3: chấp nhận đƣợc 4: đạt các chỉ tiêu đặc trƣng 5: tốt
Chú ý dùng nƣớc thanh vị sau mỗi lần thử.
Trả lời:
Mẫu Hình thức bên ngoài Màu vỏ quả Màu thịt quả Mùi vị thịt quả Điểm A
B C D
4 + + 0 5 - 0 - 6 + 0 - 7 - 0 + 8 + 0 + 9 0 - 0 10 0 + 0 11 0 - + 12 0 + + 13 0 0 0 14 0 0 0 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0
Tiến hành thực hiện như sau:
+ Lựa chọn các thông số ảnh hƣởng và khoảng biến thiên của các yếu tố đó. + Xây dựng ma trận thực nghiệm và tiến hành thí nghiệm theo ma trận. + Tìm hệ số hồi quy.
+ Kiểm định sự có nghĩa của hệ số hồi quy. + Kiểm định sự tƣơng thích của mơ hình đã chọn.
+ Tối ƣu hóa hàm mục tiêu đã chọn bằng phƣơng pháp hàm mong đợi, phƣơng pháp này gồm ba bƣớc thực hiện:
- Thiết lập hàm mục tiêu: Yi=fi(X1, X2,..., Xk). - Chuyển đổi hàm mục tiêu thành hàm d: di=Ti(Yi) - Thiết lập hàm mong đợi: D=g(d1, d2,...,dm)
2.2.8 Phƣơng pháp đánh giá an toàn của chế phẩm bảo quản chứa tinh dầu nghệ vàng
Thử nghiệm độc tính bán cấp của chế phẩm đƣợc tiến hành tại Khoa Dƣợc lý, Viện kiểm nghiệm thuốc TW, 48 Hai Bà Trƣng, Hà Nội theo phƣơng pháp Abraham, quy định của tổ chức y tế thế giới và Bộ Y Tế về hiệu lực an toàn thuốc 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 [27,138].
Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng giống Swiss, cân nặng 18-20g/con, số lƣợng 40 con đƣợc chia thành các lơ thí nghiệm, mỗi lơ 10 con do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Điều kiện chăm sóc: động vật thí nghiệm đƣợc nuôi trong điều kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột. Tất cả động vật thí nghiệm đƣợc để ổn định trƣớc khi tiến hành thử nghiệm và theo dõi cân nặng trong quá trình thử nghiệm.
Chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam - BQC đƣợc dùng nguyên trạng, khơng pha lỗng. Các mức liều thử nghiệm:
- Mức liều 1: 20 ml mẫu thử/kg chuột x 1 lần uống/ngày - Mức liều 2: 20 ml mẫu thử/kg chuột x 2 lần uống/ngày - Mức liều 3: 20 ml mẫu thử/kg chuột x 3 lần uống/ngày Mỗi lần uống cách nhau 2 giờ
Các bƣớc tiến hành
- Chuột đƣợc nhịn ăn 15 giờ trƣớc khi thí nghiệm, nƣớc uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trƣớc khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng đƣợc đƣa đi thử nghiệm.
- Cách dùng: đƣa mẫu thử dƣới dạng hỗn dịch theo đƣờng uống. Lấy thể tích mẫu thử theo qui định đƣa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù. Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 40 chuột, chia thành 4 nhóm gồm nhóm đối chứng dùng nƣớc cất và ba nhóm thử theo mức liều đã dự định. Các nhóm thử đƣợc dùng hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần đƣa mẫu thử nhƣ bảng 2.8.
Bảng 2. 8: Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp của các mẫu BQC
Nhóm chuột Liều dùng (ml mẫu/20g chuột) Liều dùng (ml mẫu/kg chuột) Số chuột Thí nghiệm Nhóm chứng 0,4 ml nƣớc cất x 3 lần - 10
Mức liều 1 0,4 ml mẫu thử x 1 lần 20 ml mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 2 0,4 ml mẫu thử x 2 lần 40 ml mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 3 0,4 ml mẫu thử x 3 lần 60 ml mẫu thử/kg chuột 10
Lịch theo dõi: theo dõi biểu hiện của chuột ngay sau khi uống, trong 24 giờ đầu và theo dõi hoạt động của động vật thí nghiệm trong thời gian 7 ngày. Cân trọng lƣợng chuột trƣớc và sau khi uống 7 ngày.
2.2.9 ức chế sinh trƣởng nấm da với tinh dầu nghệ vàng
- Lấy 500µl m gây bệnh trên da
eppendorf trộn đều với 100µl tinh dầu có nồng độ ức chế tối thiểu
60’, te ừ khuẩn lạc phát triển
2.2.10 Phƣơng pháp đánh giá các chỉ tiêu cảm quan, hóa lí của chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng da có chứa tinh dầu nghệ vàng
a. Xác định pH: Để đảm bảo sản phẩm đến tay ngƣời tiêu dùng an tồn thì pH đạt 6,5-7 và đo bằng máy đo pH do độ nhớt của dung dịch cao nên khó thực hiện bằng các chỉ thị màu
b. Xác định khả năng chịu nhiệt: Duy trì chế phẩm ở nhiệt độ 40oC trong 24h, sau đó để ở nhiệt độ phòng đến khi sản phẩm trở lại trạng thái ban đầu
c. Xác định khả năng chịu lạnh: Duy trì chế phẩm ở nhiệt độ -5oC -0 oC trong 24h, sau đó để ở nhiệt độ phịng kiểm tra vẫn khơng bị tách nƣớc
d. Đánh giá cảm quan:
- Trạng thái: Hệ nhũ tƣơng đồng nhất, mịn mặt, khơng có tạp chất lạ - Màu sắc: Có màu trắng, đồng đều
- Mùi: Thơm dễ chịu, thoang thoảng mùi nghệ
- Ngoại quan: khơng có vật bất thƣờng, tốc độ lan nhanh và khô trên da
2.2.11 Phƣơng pháp đánh giá độ kích ứng da của chế phẩm chăm sóc da
Thử kích ứng trên da là một phƣơng pháp sinh học dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với chất thử so với phần da kế bên khơng đắp chất thử (tiêu chuẩn độ kích ứng da và phƣơng pháp thử của Bộ Y Tế áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm và ban hành kèm theo Quyết định số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trƣởng Bộ Y tế. Tiêu chuẩn này cũng phù hợp với ISO 10993-10).
Cách tiến hành
Động vật thí nghiệm: Thỏ khỏe mạnh, khơng phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm trọng lƣợng 1,8-2,2kg. Trƣớc khi thí nghiệm theo dõi từ 4-5 ngày đều ni dƣỡng ở nhiệt độ phòng, thức ăn tổng hợp, nƣớc uống tự do, nhanh nhẹn, lơng mƣợt, khơng có bệnh ngồi da và đƣờng tiêu hóa.
Thử nghiệm đƣợc tiến hành trên 6 thỏ.
Dùng dao cạo sạch lông thỏ từ giữa lƣng sang hai bên khoảng 10cm, sát trùng bằng cồn 70% trƣớc khi đặt mẫu thử. Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lƣng đã cạo đặt một điểm chất thử với liều 0,5g. Trong nghiên cứu này, đặt bên phải là thuốc kem chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu.
Đặt mẫu thử đã chuẩn bị ở trên lên miếng gạc khơng gây kích ứng 2,5 cm x 2,5 cm. Cố định miếng gạc bằng băng dính khơng gây kích ứng ít nhất trong 4 giờ. Sau đó bỏ gạc và băng dính, chất thử cịn lại đƣợc làm sạch bằng dung mơi thích hợp khơng gây kích ứng.
Quan sát và ghi điểm
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt chất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 4 giờ, 24 giờ , 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định
Bảng 2. 9: Mức độ phản ứng trên da thỏ
Phản ứng Điểm đánh giá
Sự tạo vẩy và ban đỏ
- Không ban đỏ
- Ban đỏ rất nhẹ(vừa đủ nhận thấy) - Ban đỏ nhận thấy rõ
- Ban đỏ vừa phải đến nặng
Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo thành vẩy dể ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ
0 1 2 3 4 Gây phù nề - Không phù nề - Phù nề rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy)
- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề phồng lên rõ) - Phù nề vừa phải (da phồng lên khoảng 1 mm)
- Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1 mm và có lan rộng ra vùng xung quanh) 0 1 2 3 4
Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể 8
Những thay đổi khác trên da cần theo dõi và ghi chép đầy đủ. Đánh giá kết quả
Trên mỗi thỏ, điểm phản ứng đƣợc tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử đƣợc lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.
Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
Bảng 2. 10: Phân loại các phản ứng trên da thỏ
Loại phản ứng Điểm trung bình
Kích ứng khơng đáng kể 0-0,4
Kích ứng nhẹ 0,5-1,9
Kích ứng vừa phải 2,0 – 4,9 Kích ứng nghiêm trọng 5,0 – 8,0
2.2.12 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm đƣợc xác định bằng phân tích phƣơng sai ANOVA với sự hỗ trợ của phần mềm R. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối đầy đủ