Loại phản ứng Điểm trung bình
Kích ứng khơng đáng kể 0-0,4
Kích ứng nhẹ 0,5-1,9
Kích ứng vừa phải 2,0 – 4,9 Kích ứng nghiêm trọng 5,0 – 8,0
2.2.12 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm đƣợc xác định bằng phân tích phƣơng sai ANOVA với sự hỗ trợ của phần mềm R. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối đầy đủ hoàn tồn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại mỗi cơng thức thí nghiệm.
Trong thí nghiệm xây dựng quy trình sử dụng chế phẩm bảo quản chứa tinh dầu nghệ vàng các thí nghiệm đƣợc bố trí theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken, với nhân kế hoạch k
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát phƣơng pháp thu nhận tinh dầu nghệ vàng
3.1.1 Hiệu quả thu nhận tinh dầu nghệ vàng bằng các phƣơng pháp khác nhau.
Nghệ tƣơi đƣợc thu hoạch sau 9 tháng ở huyện Khoái Châu, tỉnh Hƣng Yên. Củ nghệ gồm có các củ cái và củ nhánh (cịn gọi là củ ngón). Các củ cái có màu vàng sẫm hơn một chút nhƣng có nhiều chất xơ, nhựa sáp hơn và vỏ dầy. Các củ ngón khi cây đủ già có màu sắc gần tƣơng đƣơng với củ cái nhƣng có vỏ mỏng hơn nhiều.Trong đề tài, chúng tơi tập trung vào tách chiết tinh dầu nghệ từ các củ ngón có độ ẩm trung bình 83% xác định bằng phƣơng pháp chƣng cất với toluene. Có thể đánh giá cảm quan chất lƣợng củ nghệ thông qua màu sắc của nó khi bẻ ra. Củ vàng sẫm từ trong ra ngoài là dùng đƣợc. Tiến hành làm nhỏ nguyên liệu kích thƣớc khoảng 4 mm để tăng khả năng tiếp xúc với dung môi, tạo điều kiện cho quá trình trích ly và chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc. Bằng phƣơng pháp tách chiết bằng dung môi kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1
Bảng 3. 1: So sánh hàm lượng tách chiết dung môi
Dung môi Dich chiết thô (%) Sáp nhựa (%) Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng tƣơi (%) Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng khô (%) n-hexane 0,80 0,025 0,07 0,01 0,63 0,01 3,2 0,01 Chloroform 0,70 0,029 0,1 0,01 0,58 0,02 2,8 0,02
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n=3
Tinh dầu nghệ vàng tan trong các dung môi không phân cực nên chúng tôi lựa chọn dung môi n-hexane và chloroform. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, hàm lƣợng tinh dầu thu đƣơc khi tách chiết bằng n-hexan cao hơn so với dung môi chloroform, đây cũng là dung môi đƣợc sử dụng phổ biến để tách các loại tinh dầu. Nhƣ vậy, hiệu suất trích ly tinh dầu bằng dung môi phụ thuộc vào bản chất của dung môi rất nhiều [38, 44, 58]. Trong sản phẩm chiết bằng dung mơi ngồi tinh dầu, các thành phần khác cũng đƣợc tách ra nhƣ chất màu curcuminoid, các lipid, nhựa sáp. Vì vậy, cơng đoạn tinh chế phức tạp, tỷ lệ bay hơi dung mơi cao.
Ngồi thu nhận tinh dầu bằng dung mơi thì phƣơng pháp thu nhận tinh dầu bằng chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc là phƣơng pháp phổ biến, đơn giản có thể cơ giới hóa, thời gian ngắn.
Bảng 3. 2: Hàm lượng tinh dầu tách chiết LCHN
Phƣơng pháp
Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng tƣơi
(%)
Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng khô (%)
LCHN 100 0,93 0,025 4,5 0,01
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n=3
Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lƣợng tinh dầu thu đƣợc bằng LCHN cho hàm lƣợng tinh dầu cao hơn khi trích ly bằng dung mơi.
Theo nghiên cứu của Apisariyakul và cộng sự, chiết tinh dầu nghệ vàng bằng n- hexane qua đêm thu đƣợc 3,7 % (w/w) [38]. Phan Minh Giang và cộng sự sử dụng các loại dung môi khác nhau để chiết tinh dầu nghệ và với chloroform, các tác giả thu đƣợc 0,03%(v/w) [20]. Garg và cộng sự chiết tinh dầu nghệ vàng trồng ở đồng bằng Ấn Độ bằng phƣơng pháp LCHN, lƣợng tinh dầu thu đƣợc (ml) tính theo trọng lƣợng tƣơi dao động trong khoảng 0,16-1,94%, tùy thuộc vào điều kiện trồng trọt [58]. Manzan và cộng sự chiết tinh dầu và curcumin nghệ vàng bằng phƣơng pháp cất LCHN lƣợng tinh dầu thu đƣợc dao động trong khoảng 0,2-0,45% trọng lƣợng tƣơi [44]. Usmart và cộng sự tách chiết tinh dầu nghệ vàng trồng ở phía bắc Nigeria bằng LCHN thu đƣợc 0,72% trọng lƣợng tƣơi [132]. Leela và cộng sự thu đƣợc 3,8% tinh dầu từ rhizome tính theo trọng lƣợng khơ [84]. Nhƣ vậy, kết quả bảng 3.2 cho thấy lƣợng tinh dầu thu đƣợc bằng LCHN từ nghệ vàng của Việt Nam khá cao so với kết quả của các tác giả khác (0,93%).
Theo khảo sát ở Việt Nam nghệ vàng là cây dƣợc liệu đƣợc trồng phổ biến đặc biệt ở miền Bắc. Tinh dầu nghệ vàng trồng ở Hịa Bình, Thanh Hóa, KomTum... cũng đã đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học [12, 13, 17, 18]. Vì vậy việc nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của tinh dầu từ nghệ vàng trồng ở Hƣng Yên là rất khả thi góp phần làm phong phú thêm tính ứng dụng cho chi Curcuma ở Việt Nam.
Từ kết quả bảng 3.1 và 3.2, chúng tôi chọn thu nhận tinh dầu bằng phƣơng pháp LCHN và theo kết quả đề tài KC.05-07/06-10 do TS Đặng Xuân Hảo chủ nhiệm, sản xuất tinh bột nghệ với hàm lƣợng curcumin cao từ giống nghệ vàng trồng ở Hƣng Yên thì đây cũng là phƣơng pháp tận thu đƣợc hàm lƣợng tinh dầu [23].
Hình 3. 1: Quy trình tách chiết tinh dầu nghệ vàng bằng phương pháp LCHN.
3.1.2 Xác định các chỉ số hóa lý của tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng các phƣơng pháp khác nhau pháp khác nhau
Mỗi loại tinh dầu phụ thuộc vào phƣơng pháp tách chiết đều có những tính chất cảm quan và tính chất lý hố đặc trƣng. Dựa vào các chỉ số hóa lý có thể đánh giá đƣợc mức độ tinh khiết, nhóm chất đặc trƣng, thời gian bảo quản… Bằng phƣơng pháp phân tích hóa lý chúng tơi xác định một số chỉ tiêu kết quả ở bảng 3.3
Loại nƣớc bằng CaSO4 khan Kiểm tra chất lƣợng Nghiền Nghiền - Tỷ lệ NL/Nƣớc: 1/5 - Nhiệt độ sôi - Thời gian: 8 h. LCHN hồi lƣu Hệ thống chƣng cất LCHN.
Tinh dầu thô
Bã nghệ Nguyên liệu nghiền, d 4 mm
Sấy khô Bột Đóng gói Tinh dầu Nghệ vàng tƣơi Bột nghệ
Bảng 3. 3: Chỉ số hóa lý của tinh dầu nghệ tách chiết bằng các phương pháp khác nhau
STT Chỉ số hóa lý Tinh dầu
LCHN Chloroform n-hexane
1 Độ trong Trong Trong Trong
2 Màu sắc Vàng nhạt Vàng Vàng
3 Mùi Thơm mùi nghệ Thơm hắc Thơm hắc
4 Vị Hơi cay Hơi đắng Hơi đắng
5 Tỷ trọng d20 20 0,827 0,884 0,870 6 Góc quay cực 28 D 270,78’ 300,6’ 330,5’ 7 Chỉ số khúc xạ n20 D 1,504 1,615 1,532 8 Chỉ số axit 2,68 3,07 3,26 9 Chỉ số ester 3,642 4,25 4,11
Kết quả bảng 3.3 cho thấy tỉ trọng của tinh dầu phụ thuộc vào thành phần hố học của nó. Những tinh dầu chứa tecpen hay những hợp chất no thƣờng có tỉ trọng dƣới 0,9, những tinh dầu chứa hợp chất có oxy, vịng thơm sunfua, metric thƣờng có tỉ trọng lớn hơn. Tỷ trọng của tinh dầu nghệ vàng khai thác bằng LCHN và dung môi đều ở mức nhỏ hơn 0,9 điều đó chứng tỏ tinh dầu chứa tecpen hay các hợp chất no
Chỉ số khúc xạ cho biết mức độ tinh khiết và các cấu tử chứa trong tinh dầu là no hay không no hoặc chứa nhân thơm. Nếu trong tinh dầu có nhiều cấu tử chứa liên kết đơi thì chỉ số khúc xạ cao. Bảng 3.3 cho thấy chỉ số khúc xạ của tinh dầu nghệ vàng đều cao hơn 1,5 trong khi tinh dầu nghệ vàng tách bằng các phƣơng pháp khác nhau đều chứa nhiều liên kết đôi. Đặt biệt trong dịch chiết bằng dung môi chloroform chỉ số này cao hơn, cho thấy tinh dầu sau trích ly lẫn nhiều tạp chất.
Góc quay cực α của tinh dầu thể hiện khả năng hòa tan tinh dầu trong dung mơi hữu cơ, nếu góc quay cực càng lớn thì tinh dầu có thể hịa tan tốt trong dung mơi hữu cơ phân cực và ngƣợc lại góc quay cực càng nhỏ thì tinh dầu hịa tan tốt trong dung môi hữu cơ không phân cực. Với kết quả thu đƣợc cho thấy tinh dầu nghệ tan ít trong dung mơi phân cực khi tách bằng LCHN nhƣng lại tan tốt hơn khi tách bằng dung mơi n-hexane do hịa tan nhiều chất khác có khả năng tan trong dung mơi phân cực.
Việc xác định các chỉ số hóa học có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác bảo quản, thu mua, chế biến và sử dụng tinh dầu vào các mục đích cần thiết. Qua những chỉ số đó có thể nhận biết đƣợc hàm lƣợng các nhóm hợp chất cần thiết, chất lƣợng và độ tinh khiết của
tinh dầu. Tùy thuộc vào phƣơng pháp khai thác và thời gian bảo quản tinh dầu mà chỉ số axit sẽ thay đổi. Nếu tinh dầu bảo quản lâu thì các hợp chất este bị thủy phân, các hợp chất aldehyt bị oxy hóa nên chỉ số axit sẽ tăng lên. Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy tinh dầu LCHN có chỉ số axit thấp hơn so với tinh dầu trích ly bằng dung mơi phản ánh tinh dầu LCHN có chất lƣợng tốt hơn và trích ly bằng dung mơi đã hịa tan nhiều tạp chất, q trình tinh chế không hiệu quả nên chất lƣợng tinh dầu giảm.
Từ phân tích các chỉ số hóa lý tinh dầu nghệ vàng cho thấy phƣơng pháp LCHN tinh sạch hơn, cho tinh dầu có chất lƣợng tốt hơn tƣơng tự của các tác giả khác [1, 12, 17, 21, 22].
Hình 3. 2: Tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng lôi cuốn hơi nước
3.1.3 tách chiết bằng các phƣơng pháp
khác nhau
Thành phần tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng dung môi và chƣng cất LCHN đƣợc
phân tíc -
- đƣợc trình bày
Bảng 3. 4: Thành phần của tinh dầu nghệ vàng khi tách chiết bằng các phương pháp khác nhau tách chiết bằng các phương pháp khác nhau
STT Thành phần Tỷ lệ (%) LCHN Chloroform n-hexane 1 p-cymene 0,10 − − 2 Myrcene 0,73 − − 3 Limonene 0,19 − − 4 1,8- cineole 0,45 − − 5 α-Terpinolene 2,27 − − 6 α-phellandrene 0,29 − − 7 β-caryophyllene 3,07 0,79 0,93 8 α- caryophyllene − − 0,37 9 4-7-10- cycloundecatriene − − 0,4 10 α-humulene 0,79 0,25 − 11 Ar-curcumene 3,02 2,96 5,11 12 α-zingiberene 3,44 − − 13 β-bisabolene 0,72 0,41 0,65 14 γ-bisabolene 0,17 15 β-sesquiphellandrene 4,42 2,01 3,14 16 ∆-3-Carene 0,10 − − 17 α-farnesene 0,23 − − 18 Caryophyllene oxide − − 1,54 19 Zingiberene 0,27 0,33 0,34 20 Ar-turmerone 30,33 − − 21 β-turmerone − 63,94 55,99 22 α-turmerone 14,14 - - 23 d-nerolidal 0,63 − − Monoterpene 4,36 - - Sesquiterpene 60,31 70,90 66,93 aldehyde 0,63 - - Oxide - - 1,54 Tổng cộng 65,31 70,90 68,47 Các chất không xác định 34,69 30,10 31,53
Hình 3. 3: Sắc ký đồ thành phần tinh dầu nghệ tách bằng lôi cuốn hơi nước
Hình 3. 5: Sắc ký đồ thành phần tinh dầu nghệ tách bằng chloroform
Dựa trên sắc ký đồ hình 3.3, 3.4, 3.5 và bảng 3.4
4,36
sesquiterpene 60,31% với hơn 30% ar-turmerone và 0,63% aldehyde. Các hợp chất chính của tinh dầu thu bằng n-hexan là β-turmerone (55,99%), ar-curcumene (5,11%), β- sesquiphellandrene (3,14%), caryophyllene oxide (1,54%) và 5 thành phần khác đƣợc nhận biết (zingiberene, β-caryophylene, β-bisabolene, 4-7-10 cycloundecatriene, α- caryophylene) mỗi loại chiếm dƣới 1%. Nhƣ vậy, có 9 thành phần đƣợc nhận biết trong dịch chiết n-hexan. Tinh dầu thu bằng dung mơi chloroform cịn xác định ít thành phần hơn (7 hợp chất), trong đó β-turmerone cũng chiếm ƣu thế (63,94%), tiếp đến là ar –curcumene (2,96%) và β- sesquiphellandrene (2,01%). Các hợp chất khác (zingiberene, β- caryophylene, β-bisabolene, α-humulene) mỗi loại dƣới 1%. Nhƣ vậy, tinh dầu thu bằng n- hexan và chloroform của thân củ nghệ từ Hƣng Yên, β-turmerone là thành phần chủ yếu. Phƣơng pháp LCHN tách chủ yếu là sesquiterpene mà thành phần chính là ar-turmerone (30,33%). Đặc biệt, ar-turmerone và monoterpene không phát hiện đƣợc trong tinh dầu chiết bằng dung mơi hữu cơ.
Nhìn chung, thành phần chính trong tinh dầu thân củ nghệ là ar-turmerone, β- turmerone, ar-cucumene nhƣng phụ thuộc vào giống, loài, điều kiện địa lý và phƣơng pháp tách chiết mà số lƣợng, hàm lƣợng các thành phần này sẽ thay đổi [44, 109, 111]. Leela và cộng sự tách chiết tinh dầu từ lá, hoa, củ nghệ trồng ở Ấn Độ, kết quả phân tích GC-MS cho thấy thành phần chính trong hoa p-cymene(26,0%), trong lá β- phellandrene (32,6%)
và trong củ là ar-turmerone (46,8%) [84]. Phân tích thành phần tinh dầu ở Nigeria xác định đƣợc 22 thành phần, - phellandrene chiếm chủ yếu [132]. Shiyou Li và cộng sự đã xác định thành phần chính trong tinh dầu ở lá và hoa là monoterpene còn trong thân củ là sesquiterpene. Đây là những thành phần đã đƣợc chứng minh có hoạt tính sinh học cao trong nghiên cứu in vitro và in vivo [124].
Kết quả phân tích thành phần tinh dầu thu đƣợc bằng LCHN có ar-turmerone, ar- cucumene, zingiberene, β-sesquiphellandrene là những thành phần đặc trƣng của tinh dầu nghệ vàng và ar-turmerone trong tinh dầu nhận đƣợc ở đây cũng tƣơng đối cao (30,33%) so với một số cơng bố khác, trong đó ar-turmerone chiếm từ 10% - 40% thành phần tinh dầu ở Việt Nam [1, 21]. Điều này cho thấy hoạt tính sinh học tiềm năng của tinh dầu nghệ vàng trồng ở Hƣng Yên.
Từ những kết quả nghiên cứu trên có thể thấy tinh dầu nghệ thu nhận bằng phƣơng pháp LCHN đơn giản, hiệu suất tách chiết cao, thời gian ngắn và vẫn giữ đƣợc các cấu tử đặc trƣng của tinh dầu nghệ vàng, vì vậy chúng tơi lựa chọn tinh dầu thu bằng LCHN để nghiên cứu trong các phần sau.
3.2. Nghiên cứu t
vàng lôi cuốn hơi nƣớc
Để tách các phân đoạn tinh dầu nghệ, một số tác giả sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, HPLC, chiết bằng CO2 siêu tới hạn …[45, 140]. Li-Hsun Chang và cộng sự đã cho thấy hiệu quả tách chiết turmerones bằng CO2 siêu tới hạn đạt 81%, đặc biệt là hàm lƣợng ar-turmeron khi tách chiết bằng LCHN (20%), nhƣng tách bằng CO2 siêu tới hạn tăng thêm 14% [45]. Zeng và cộng sự đã tách và phân đoạn sesquiterpenes từ
Curcuma longa để nghiên cứu cấu trúc bằng cột silicagel với các loại dung môi khác nhau
[145]. Tại Việt Nam, Phan Minh Giang và cộng sự đã tách chiết sesquiterpenes từ các giống nghệ khác nhau cũng bằng phƣơng pháp sắc ký cột. Kết quả nhận đƣợc cho thấy, các sesquiterpenes tập trung ở các phân đoạn kém phân cực [19, 20]. Hiện nay, trong quy trình sản xuất tinh bột nghệ có hàm lƣợng cucumin cao bằng việc loại bỏ nhựa và tinh dầu trong nghệ vàng bằng phƣơng pháp phân tách các phân đoạn dƣới áp suất thấp với nhiệt độ bay hơi khác nhau [23]. Đây cũng là phƣơng pháp để thu nhận tinh dầu từ quy trình khai thác curcumin mà khơng làm ảnh hƣởng tới hoạt tính sinh học của chúng. Vì vậy, phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng để phân tách các phân đoạn chứa cacbua terpene, sesquiterpene và turmerones từ tinh dầu nghệ vàng thu đƣợc bằng phƣơng pháp cất lôi cuốn hơi nƣớc. Kết
Bảng 3. 5: Kết quả tách phân đoạn tinh dầu nghệ vàng LCHN ở áp suất 20mmHg
STT Nhiệt độ thiết bị ổn nhiệt (oC) Thể tích thu đƣợc (ml)
1 40 0 2 50 0 3 60 0 4 70 0 5 80 0 6 90 60 7 120 45 8 140 25
Nhƣ vậy ở áp suất 20mmHg, nhiệt độ bình ổn nhiệt từ 40oC đến 80o
C các thành phần tinh dầu vẫn chƣa tách đƣợc. Khi nâng nhiệt độ lên 90oC, các thành phần dễ bay hơi bắt đầu tách khỏi hỗn hợp và ngƣng tụ lại, thu đƣợc phân đoạn 1 với thể tích cao nhất trong các phân đoạn là 60ml, và thể tích phân đoạn hầu nhƣ khơng đổi trong khoảng thời gian bắt đầu từ phút 45 của quá trình tách. Vì vậy chúng tôi tiến hành ngừng tách phân đoạn này trong khoảng thời gian là 1 giờ. Tiếp tục nâng nhiệt độ lên 120o