Mức và khoảng
biến thiên Giá trị mã
Giá trị thực
X1 (%) X2 (giây) Số lần nhúng X3
Mức dƣới -1 94 20 1
Mức cơ sở 0 96 40 2
Mức trên +1 98 60 3
Khoảng biến thiên 1 2 20 1
Để đảm bảo xác suất tin cậy, các thí nghiệm ở mỗi điểm đều đƣợc lặp lại 3 lần, thí nghiệm đa yếu tố theo phƣơng án trung tâm hợp thành trực giao với 17 thí nghiệm, các thông số biến thiên qua 2 mức. Kết quả thực nghiệm theo quy hoạch bậc 2 Box-Behnken.
Tiến hành xây dựng hàm hồi quy cho mục tiêu nhƣ sau:
T
Y (%)=a0 + a1 X1 + a2 X2 + a3 X3 + a12 X1X2 + a13 X1X3 + a23 X2X3 + a11 X12 + a22
X22 + a33 X32 .
Từ điều kiện thơng số thí nghiệm, mơ hình thí nghiệm sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng BQC bảo quản cam đã đƣợc xây dựng. Ma trận kế hoạch thực nghiệm và kết quả
ảnh hƣởng của các yếu tố nồng độ, thời gian và số lần nhúng đến tỉ lệ tổn thất khối lƣợng thể hiện ở bảng 3.26
Bảng 3. 26: Mơ hình thí nghiệm đa yếu tố ảnh hưởng đến tỉ lệ tổn thất của chế phẩm
TN X1 X2 X3 YT (%) 1 -1 -1 0 8,58 2 1 -1 0 7,83 3 -1 1 0 7,65 4 1 1 0 7,77 5 -1 0 -1 8,11 6 1 0 -1 7,95 7 -1 0 1 8,25 8 1 0 1 7, 85 9 0 -1 0 7,65 10 0 1 0 7,03
11 0 -1 1 7,04 12 0 1 1 7, 11 13 0 0 0 7,18 14 0 0 0 7, 00 15 0 0 0 7,26 16 0 0 0 7,22 17 0 0 0 7,24
Kiểm tra sự có nghĩa của mơ hình và các hệ số đƣợc tiến hành bằng phân tích hồi quy. Chuẩn F của mơ hình đƣợc xác định là 20,59 (YT ), cho thấy mơ hình hồn tồn có ý nghĩ với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001). Các giá trị p<0,05 cho biết các hệ số hồi quy có nghĩa, nhƣ vậy mơ hình này có các hệ số hồi quy X1, X2, X1 X2, X2 X3, X12. Hệ số tƣơng quan bội R2 của mơ hình này là 0,9636, cho thấy sự tƣơng thích cao của mơ hình. Sự thay
đổi của hàm mục tiêu phụ thuộc vào các biến ảnh hƣởng. Vậy hiệu quả sử dụng chế phẩm thông của tỉ lệ tổn thất khối lƣợng đƣợc biểu diễn nhƣ sau:
T
Y = 1876,23– 38,68 X1 – 0,54258 X2 + 0,005 X1X2 - 0,008 X2X3 + 0,2X12
Kết quả phân tích hồi quy đƣợc trình bày ở bảng 3.27 nhƣ sau:
Bảng 3. 27: Kết quả phân tích hồi quy
TT Nguồn gốc Phƣơng sai Chuẩn F
1 Mơ hình 0,40 20,59 2 X1 0,18 9,20 3 X2 0,30 15,41 4 X1 X2 0,19 9,83 5 X2 X3 0,12 6,19 6 X12 2,70 140,38
Xét các yếu tố ảnh hƣởng đến tỉ lệ tổn thất khối lƣợng, hình 3.30 cho thấy nồng độ chế phẩm (X1) ảnh hƣởng lớn nhất đến tỉ lệ tổn thất khối lƣợng của cam trong thời gian bảo quản, sau đó đến thời gian tiếp xúc (X2) nhƣng ở mức độ thấp hơn. Còn số lần nhúng chế phẩm (X3) thì ít ảnh hƣởng đến tổn thất khối lƣợng của quả.
Hình 3. 30: Ảnh hưởng của các yếu tố đến tỉ lệ tổn thất khối lượng
Hình 3. 311: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm và số lần nhúng tới tỉ lệ tổn thất
Hình 3. 322: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm, thời gian tiếp xúc tới tỉ lệ tổn thất
Hiệu quả bảo quản của chế phẩm chịu ảnh hƣởng lớn nhất bởi nồng độ chế phẩm, nồng độ chế phẩm tăng thì tỉ lệ tổn thất khối lƣợng giảm. Tuy nhiên nếu nồng độ chế phẩm quá cao cũng sẽ tăng chi phí. Thời gian nhúng cũng ảnh hƣởng đến tỉ lệ tổn thất khối lƣợng, khi thời gian tiếp xúc tăng sẽ tạo khả năng bám dính giữa chế phẩm với quả ổn định. Số lần nhúng cũng có ảnh hƣởng đến tỉ lệ tổn thất nhƣng mức độ ít và chịu tác động qua lại của yếu tố thời gian tiếp xúc với chế phẩm
3.5.6.2. Tối ưu hóa
Hiệu quả sử dụng chế phẩm BQC bảo quản cam cần đƣợc tối ƣu nhằm mục đích giảm tỉ lệ tổn thất khối lƣợng mà chất lƣợng cảm quan và hiệu quả kinh tế vẫn tốt, vì vậy thuật tốn hàm mong đợi đã đƣợc sử dụng để giải bài tốn tối ƣu hóa. Kết quả tối ƣu hóa bằng phần mềm Design-Expert 7.1 nhƣ sau: Nồng độ chế phẩm 96%, thời gian tiếp xúc 60 giây, số lần nhúng 1; khi đó tỉ lệ tổn thất khối lƣợng đạt 6,98%. Với điều kiện tối ƣu này thì mục tiêu về hiệu suất đạt 100% mong muốn. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.33.
Hình 3. 33: Mức độ đáp ứng sự mong đợi giảm tỉ lệ tổn thất khối lượng khi sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng BQC bảo quản cam
Từ các kết quả tối ƣu ở trên, tiến hành đo độ bám dính của chế phẩm trên bề mặt quả sau nhúng theo thời gian 1, 3, 5, 15, 20 phút bằng máy NiKKO- Eclipse E600 theo TCVN 2097:1993 – Phƣơng pháp cắt để xác định độ bám dính của màng. Do vỏ cam cứng nên mỗi đƣờng cắt cách nhau 1 mm, dao cắt đƣợc dùng có độ sắc từ 20-30o. Trên mỗi quả đƣợc phủ chế phẩm cắt ở 3 vị trí khác nhau (Hình 3.34).
Hình 3.34 cho thấy độ bám dính của chế phẩm ổn định dần theo thời gian và tại các vết cắt màng chỉ bị bong các mảnh nhỏ tại các điểm giao nhau, diện tích màng bị bong khơng q 15% ở thời gian 5 phút tƣơng ứng với điểm 2 trong TCVN 2097:1993. Sau 15 phút độ bám dính của màng ổn định. Kết quả này cho thấy màng có độ bám dính cao nên có thể phủ lên bề mặt quả dễ dàng, đồng thời giảm tỷ lệ hƣ hỏng màng (bong, rạn nứt) trong quá trình bảo quản cam. Độ dày màng phủ của chế phẩm BQC sau 20 phút bằng phƣơng pháp nhúng là 4,53μm. Theo các tài liệu nghiên cứu thì độ dày của chế phẩm dạng phủ màng phụ thuộc vào nồng độ chất khô trong chế phẩm, phƣơng pháp sử dụng chế phẩm và đặc điểm cấu tạo bề mặt, diện tích vỏ quả. Thơng thƣờng theo phƣơng pháp xoa thì độ dày màng mỏng hơn so với phƣơng pháp nhúng và phun nhƣng để có thể cơ giới hóa thì phƣơng pháp nhúng là phổ biến. Từ đây chúng tơi thiết lập quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng bảo quản cam nhƣ mục 3.5.7
3.5.7 Quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng bảo quản cam
3.5.7.1 Quy trình tạo chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng BQC
Thành phần của chế phẩm BQC gồm: nƣớc, gelatin, axit citric, stearic acid, glycerol, tinh dầu nghệ vàng, CaCl2, tween-80. Quy trình gồm 2 cơng đoạn:
Dung dịch 1: pha CaCl2 nồng độ 1% trong nƣớc, khuấy cho tan hoàn toàn và bổ sung acid citric nồng độ 1%
Dung dịch 2: Gelatin nồng độ 4 % pha trong nƣớc 45 ± 2o
C, ngâm 15 phút và khuấy cho tan hoàn tồn. Lọc dung dịch qua vải thơ để loại bỏ hết những thành phần khơng hịa tan. Bổ sung glycerol nồng độ 0,85%, stearic acid nồng độ 0,5%, tween 80 nồng độ 0,1% và tinh dầu nghệ vàng nồng độ 0,5%. Khuấy đồng nhất dung dịch bằng thiết bị IKA T25 tốc độ 500 vòng/phút trong thời gian 10 phút.
Cho dung dịch 1 bổ sung vào dung dịch 2, khuấy và đồng nhất tạo chế phẩm BQC.
3.5.7.2 Sơ đồ quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng bảo quản cam qui mơ phịng thí nghiệm
Hình 3. 35: Quy trình sử dụng chế phẩm BQC bảo quản cam
Thuyết minh quy trình:
Cam Hà Giang đƣợc thu hái ở giai đoạn 212 – 221 ngày sau khi đậu quả, khối lƣợng không nhỏ hơn 0,15 kg. Biểu hiện bên ngồi là: vỏ có màu xanh hơi bóng, hơi vàng nhạt. Phần vỏ xốp có màu hơi vàng. Chính giữa đáy trái xuất hiện đốm trịn (đƣờng kính khoảng 1,5-2cm) vị chua ngọt hài hòa. Dùng dao hoặc kéo cắt sát cuống rồi cho vào túi vải hoặc giỏ, sọt có lót giấy hoặc rơm để tránh xây xƣớc. Không nên thu hái khi trời nắng nóng, vì lúc này nhiệt độ cao, quả hô hấp mạnh làm giảm chất lƣợng cam và hiệu quả bảo quản. Sau cơn mƣa hoặc lúc sƣơng mù chƣa tan hết cũng không nên thu hái cam để tránh bị nấm bệnh xâm nhập gây thối quả. Sau khi thu hái, cần lựa chọn những quả tƣơi, đồng đều về hình thức, kích thƣớc, khơng bị sâu bệnh, vỏ quả khơng có các vết sần sùi, chai cứng để đem bảo quản.
Cam sau thu hoạch
Lựa chọn/Phân loại
Rửa sạch Nhúng quả vào chế phẩm BQC Để khơ Để khơ Đóng thùng Bảo quản
Rửa quả bằng nƣớc sạch tránh tác động cơ học quá mạnh để loại bỏ các vi sinh vật bám trên vỏ quả. Sau đó quả đƣợc để khơ tự nhiên 80-90% giúp tăng khả năng bám chế phẩm khi xử lý và tránh pha loãng dung dịch
Xử lý bảo quản cam bằng nhúng một lần trong thời gian 1 phút vào chế phẩm có nồng độ 94-100%. Sau đó tiến hành để khơ tự nhiên 20 - 30 phút, đảm bảo cố định chế phẩm BQC trên quả.
Quả sau xử lý đặt lên khay, bảo quản trong hộp cacton sạch có đục lỗ để trao đổi khí và ẩm ở điều kiện nhiệt độ thƣờng. Xuất kho sau khi quả đạt các chỉ tiêu theo dõi và đƣợc đánh giá cảm quan tốt.
Ƣu điểm của chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng BQC trong bảo quản cam
- Dễ sử dụng do yêu cầu kỹ thật đơn giản, không yêu cầu nhân lực trình độ cao - Thân thiện với mơi trƣờng và an tồn
- Có thể phối chế vào màng các hợp chất theo ý muốn
- Dễ dàng cơ giới hóa khâu sử dụng nhƣ trong hệ thống xƣởng sơ chế - Chế phẩm có thể triển khai với quy mơ lớn
Nhƣợc điểm khi sử dụng chế phẩm bảo quản ở những ngày đầu cam sẽ có mùi nghệ thoang thoảng nhƣng sẽ hết trong thời gian bảo quản. Ngoài ra, chế phẩm nên đƣợc pha chế với tinh dầu nghệ trƣớc khi bắt đầu bảo quản, khơng nên pha chế sẵn sẽ giảm hoạt tính của các thành phần trong tinh dầu nghệ.
3.6 Nghiên cứu tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ
3.6.1 Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng nấm da của tinh dầu nghệ vàng
Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh trên da của tinh dầu nghệ bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các chủng nấm đƣợc phân lập từ nguồn bệnh tại Viện Da Liễu Trung Ƣơng và tiến hành cấy bào tử nấm mốc, sinh khối nấm men với mật độ khoảng 108 CFU/ml trên mơi trƣờng sabourand. Tấm giấy lọc có đƣờng kính 5 mm đã khử trùng. Lấy 20µl tinh dầu nghệ vàng thơ thấm vào giấy lọc và đặt lên đĩa thạch có cấy vi sinh vật thử nghiệm. Tƣơng tự nhƣ vậy, chuẩn bị tấm giấy lọc có kháng sinh tiêu chuẩn chứa
gentamycin 80μg và 10μg của streptomycin vô trùng làm đối chứng dƣơng để so sánh hoạt tính đối kháng nấm của tinh dầu nghệ. Các đĩa petri đƣợc ủ ở 300C trong 36 giờ. Kết quả thu đƣợc nhƣ trên bảng 3.28
Bảng 3. 28: Hoạt tính kháng nấm da của tinh dầu nghệ vàng
Chủng vi sinh vật Đƣờng kính vịng kháng (D-d),cm
Tinh dầu nghệ vàng Gentamycin Streptomycin
Candida albicans 2,5 ± 0,07 1,35 ± 0,05 1,5 ± 0,15
Trychophytol mentargrohytes
2,0 ± 0,23 1,1 ± 0,04 1,3 ± 0,01
Kết quả trên cho thấy, tinh dầu nghệ vàng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên da rất tốt [148]. Tinh dầu thơ cho đƣờng kính vịng kháng khuẩn 2,5 cm đối với Candida albicans và 2,0 cm đối với Trychophytol mentargrophytes, cao hơn so với 2 loại kháng
sinh đối chứng. Kết quả này cũng tƣơng tự với kết quả của Valero và cộng sự cho rằng các loại tinh dầu có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật có hoạt tính kháng nấm da tốt [135]. Nhiều loại tinh dầu đã đƣợc thử nghiệm in vitro và in vivo cho thấy hoạt tính kháng nấm có thể đƣợc khai thác nhƣ thuốc kháng nấm tiềm năng [77]. Cơ chế hoạt động của tinh dầu tác động chủ yếu lên màng tế bào nấm, phá vỡ cấu trúc màng, ngăn chặn sự tổng hợp màng tế bào, ức chế sự nảy mầm bào tử, sự phát triển nấm và hô hấp tế bào [66, 67]. Sharma và cộng sự đã nghiên cứu thuốc thảo dƣợc có chứa bột thân rễ nghệ vàng chữa khỏi bệnh nấm ngoài da gây ra bởi Trychophyton verrucosum cho 12 con gia súc và Microsporum canis
cho 21 con chó trong vịng 12-15 ngày điều trị [122].
Ảnh hƣởng của các nồng độ tinh dầu nghệ vàng khác nhau tới sinh trƣởng của hai loại nấm nghiên cứu đã đƣợc xác định (bảng 3.29)
Bảng 3. 29: Ảnh hưởng nồng độ tinh dầu nghệ vàng lên sinh trưởng các chủng nấm da nghiên cứu
Nồng độ tinh dầu (%) Đƣờng kính đối kháng (D-d), mm
Candida albicans Trychophytol mentargrohytes
0 0,0 0,0 0,3 0,3 ± 0,37 0,2 ± 0,11 0,5 1,6 ± 0,28 0,9 ± 0,18 0,7 1,7 ± 0,54 1,4 ± 0,15 1,0 1,8 ± 0,32 1,6 ± 0,18 1,5 2,2 ± 0,58 1,9 ± 0,08 2,0 2,6 ± 0,71 2,2 ± 0,13 2,5 3,0 ± 1,73 2,6 ± 0,11 3,0 3,3 ± 1,03 3,1 ± 0,17
Tin đã bắt đầu thể hiện hoạt tính ức chế sinh trƣởng của Candida albicans, và Trychophytol mentargrohytes nhƣng khơng rõ ràng,
đƣờng kính vịng kháng nấm nhỏ và rất mờ. Theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, kh không chỉ tinh dầu nghệ vàng, mà tinh dầu một số loại nhƣ tỏi, đinh hƣơng, quế…đều tăng theo sự tăng của n [76]. Kết quả bảng 3.29 nhận đƣợc cho thấy, nồng độ ức chế tối thiểu của tinh dầu nghệ thu đƣợc bằng phƣơng pháp LCHN là 0,5% cho Candida albicans và 0,7% cho Trychophytol mentargrohytes [148]. Kết quả này cũng tƣơng tự của Wuthi-udomlert và cộng sự đánh giá
hoạt tính đối kháng nấm da của tinh dầu nghệ [139]. Điều này cho thấy việc sử dụng tinh dầu nghệ trong việc điều trị nhiễm nấm da là rất khả quan và đã có một số nghiên cứu tiền lâm sàng đƣợc tiến hành với thuốc mỡ có chứa tinh dầu của Trachyspermum ammi [70] và
Curcuma longa [40].
3.6.2 da của tinh dầu nghệ vàng
Để xác định thời gian tối thiểu tinh dầu nghệ có thể tiêu diệt hồn tồn các chủng nấm nghiên cứu, thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: các chủng nấm đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng mật độ 108
CFU/ml, bổ sung tinh dầu nghệ vàng nồng độ 0,5 % cho C. albicans và 0,7% cho T. mentagrophyte. Sau các khoảng thời gian nhất định, cấy trải 20 µl canh trƣờng ni lên đĩa petri có mơi trƣờng sabouraud. Xác định số khuẩn lạc phát triển (bảng 3.30).
Bảng 3. 30: Ảnh hưởng của thời gian phơi nhiễm lên khả năng diệt nấm của tinh dầu nghệ vàng
khuẩn lạc (CFU/ml) Thời gian( phút) Candida albicans Trychophytol mentargrohytes 0 8,6.103 7,48.103 5 5,36. 103 5,54.103 10 2,96. 103 3,36.103 15 2,08. 103 3.103 20 1,76. 103 2,52.103 25 1,48. 103 1,92.103 30 0,2. 103 0,84.103 45 0,12. 103 0,56.103
60 0 0,4.103
90 0 0
120 0 0
Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.30 và hình 3. 36, 3.37 đối với 2 chủng nấm gây bệnh trên da C. albicans và T. mentagrophytes cho C. albicans bị tiêu diệt hoàn toàn sau 1 giờ ủ với tinh dầu nghệ, và T. mentagrophytes chịu đƣợc tác động của tinh dầu nghệ tốt hơn. Loài này chỉ bị tiêu diệt hoàn toàn sau 90 phút ủ với tinh dầu nghệ.
Một số nghiên cứu đánh giá hoạt tính và cơ chế của tinh dầu tác động đến nấm da nhƣ Pintovà cộng sự thấy rằng tinh dầu Thymus pulegioides nồng độ 0,08 µg/ml làm giảm hàm lƣợng ergosterol của loài T. rubrum xuống 70% [107]. Cơ chế hoạt động dựa trên suy giảm sinh tổng hợp ergosterol đã đƣợc giả thuyết nhƣ với thuốc kháng nấm azole [76]. Inouye và cộng sự bằng kính hiển vi điện tử quan sát thấy tinh dầu phá hủy màng tế bào và thành tế bào phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tiếp xúc [71]. Park đã phân tích cơ chế hoạt động của eugenol, một hợp chất chính trong tinh dầu Syzygium aromaticum với lồi T.
mentagrophytes và quan sát thấy sự phá hủy màng ty thể bên trong, vách tế bào, mạng