CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC CỦA CÁC CĂN NGUYÊN
VI RƯT GÂY BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HƠ HẤP CẤP
1.2.1. Trên thế giới
Hội chứng VĐHHC xảy ra quanh năm với tỷ lệ cao trong mùa thu và mùa đông ở các vùng ôn đới. Ở vùng nhiệt đới, bệnh VĐHHC xảy ra nhiều hơn vào lúc thời tiết ẩm và lạnh. Theo những nghiên cứu tại khu vực địa lý khác nhau, vi rút cúm, RSV, vi rút Rhino là tác nhân gây bệnh chính trong số các vi rút là gây VĐHHC.
Nghiên cứu ở Brazil, Colombia và Thái Lan cho thấy RSV là căn nguyên 20-30% các trƣờng hợp VĐHHC ở trẻ em từ 1-4 tuổi, một tỷ lệ tƣơng tự nhƣ ở các nƣớc cơng nghiệp hóa. Tuy nhiên, mơi trƣờng văn hóa và lối sống dƣờng nhƣ ảnh hƣởng đến đặc điểm mùa của RSV [132]. Ở châu Âu và Bắc Mỹ, RSV xảy ra vào mùa đông và mùa xuân. Nghiên cứu ở các nƣớc đang phát triển với khí hậu ơn đới, nhƣ Argentina, cho thấy sự lƣu hành của RSV cũng tƣơng tự nhƣ ở Châu Âu và Bắc Mỹ. Các nghiên cứu ở các nƣớc nhiệt đới cho thấy RSV thƣờng lƣu hành chủ yếu vào mùa mƣa [44].
Vi rút á cúm cũng gây ra các bệnh nhiễm trùng đƣờng hơ hấp trên với 30-50% trong số đó biến chứng viêm tai giữa hay nhiễm trùng đƣờng hô hấp với 0,3% trong số đó phải nhập viện. Phần lớn trẻ em bị nhiễm vi rút á cúm phân typ 3 (PIV-3) ở lứa tuổi nhỏ hơn 2 tuổi và á cúm phân typ 1 và 2 (PIV-1 và PIV-2) ở lứa tuổi nhỏ hơn 5 tuổi. Viêm thanh quản là dấu hiệu lâm sàng của nhiễm vi rút á cúm khác, đặc biệt là PIV-1, và là nguyên nhân chính ở trẻ em từ 2đến 6 tuổi nhập viện. Tỷ lệ nhập viện liên quan đến nhiễm PIV khác nhau trong nghiên cứu. Tại Hoa Kỳ, hàng năm PIV-1 đƣợc ƣớc tính chiếm khoảng 5.800 đến 28.900 ca nhập viện, PIV-2:1.800 đến 15.600 ca nhập viện và PIV-3: 8700 đến 52.000 nhập viện [10].
Tại Hoa Kỳ, ƣớc tính 25-50 triệu trƣờng hợp mắc bệnh cúmmỗi năm (tƣơng đƣơng với khoảng 20% dân số), trong đó 150.000-200.000 trƣờng hợp nhập viện và 30.000 - 40.000 trƣờng hợp tử vong. Nếu ngoại suy các con số này, gánh nặng bệnh tật trung bình tồn cầu của cúm theo mùa là 600 triệu trƣờng hợp, trong đó 3 triệu trƣờng hợp có biểu hiện lâm sàng nặng và 250.000 – 500.000 ca tử vong mỗi năm. Tỷ lệ nhập viện của những trƣờng hợp có biểu hiện lâm sàng nặng 3-6/1000 với trẻ trên 23 tháng tuổi và 9/1000 với trẻ nhỏ hơn 6 tháng tuổi. Theo nghiên cứu tại Hồng Kông và Campuchia, tỷ lệ căn nguyên do vi rút gây VĐHHC cho trẻ < 5 tuổi nhập viện là 47% và 55%, trong đó, vi rút Rhino, RSV, á cúm và cúm A là những tác nhân chính [48, 112]. Kết quả này cũng tƣơng tự với nghiên cứu tại Malaysia khi tiến hành nghiên cứu hồi cứu 10.269 trẻ em < 5 tuổi trong 17 năm (1982-2008), căn nguyên chính là RSV (70,6%), vi rút á cúm (13,2%) và vi rút cúm (11%) [63]. Trong khi đó, nghiên cứu tại Philippine từ tháng 5/2008 đến tháng 5/2009 với trẻ từ 8 tháng đến 13 tuổi nhập viện do VĐHHC, căn nguyên vi rút chiếm 61,2%. Số trẻ tử vong do viêm phổi là 70/819 trƣờng hợp (8,5%), trong đó xác định đƣợc căn nguyên do một loại vi rút hoặc đồng nhiễm (2 hoặc 3 loại vi rút) là 35/70
trƣờng hợp (50%). Vi rút cúm A đƣợc xác định là một trong những căn nguyên gây tử vong cao nhất [114].
Trong nghiên cứu tại Nam Phi năm 2009- 2010 đã xác định các tác nhân vi rút hô hấp (57%) của bệnh nhân viêm phổi điều trị tại bệnh viện trong và sau đại dịch cúm A/H1N1/2009, trong đó tỷ lệ nhiễm một loại vi rút là 40%, đồng nhiễm 2-3 loại vi rút là 17% [97].
1.2.2. Tại Việt Nam
Việt Nam là nƣớc đang phát triển, với dân số trên 90 triệu ngƣời, có khí hậu nhiệt đới (miền Nam) và cận nhiệt đới (miền Bắc), duy trì kiểuhình nóng, ẩm, mƣa nhiều nên bệnh VĐHHC có thể phát hiện quanh năm, có xu hƣớng tăng ở những tháng giao mùa. Bệnh VĐHHC trong cộng đồng có tỷ lệ cao, trung bình trong 5 năm 1996-2000 là 1. 627,2/100.000 dân, đứng đầu trong số 26 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất ở Việt Nam [9]. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc khác nhau theo phân vùng địa lý và khí hậu. Miền Bắc và Tây Ngun có nhiều vùng núi cao, khí hậu 4 mùa nên hội chứng VĐHHC phát triển nhiều trong các mùa thu, mùa đông và mùa xuân với tỷ lệ mắc trung bình 5 năm cuối của thập kỷ 90 là 2.298,6/100.000 dân ở miền Bắc và 3.160/100.000 dân ở Tây Nguyên. Tỷ lệ này thấp hơn ở miền Trung và miền Nam nơi duy trì khí hậu nhiệt đới với hai mùa khô và mùa mƣa trong năm.
Tại Việt Nam, một số vụ dịch do căn nguyên vi rút cúm, vi rút á cúm, vi rút Adeno… đã đƣợc ghi nhận ở nhiều địa phƣơng. Các nghiên cứu tại viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng trong những năm 1957-1958, dịch cúm do vi rút cúm A/H2N2 và năm 1968-1969, dịch cúm do vi rút cúm A/H3N2 đã xâm nhập vào Việt Nam và lan rộng khắp các tỉnh miền Bắc. Tuy nhiên, việc giám sát cúm chủ yếu dựa trên các dấu hiệu lâm sàng và đƣợc chẩn đoán, báo cáo là hội chứng cúm.
Tháng 2/2003, vi rút SARS-CoV là tác nhân gây hội chứng viêm đƣờng hơ hấp cấp tính nặng (SARS - Severe Acute Respiratory Syndrome) đã đƣợc xác định với 63 trƣờng hợp mắc, 5 trƣờng hợp tử vong. Tháng 12/2003, vi rút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã lây truyền từ gia cầm sang ngƣời, đến nay đã có 123 trƣờng hợp mắc, trong đó có 61 trƣờng hợp tử vong (49,5%). Và gần đây nhất là dịch cúm A/H1N1/2009 đại dịch xuất hiện trên thế giới và tại Việt Nam từ tháng 3/2009 đã khiến Tổ chức Y tế thế giới nâng mức cảnh báo nguy cơ đại dịch lên mức cao nhất (mức 6) [131].
Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, đã có một số nghiên cứu về căn nguyên gây VĐHHC. Nghiên cứu của Huỳnh Phƣơng Liên và cộng sự về vi rút cúm và các vi rút gây VĐHHC ở Hà Nội năm 2001 cho thấy vi rút lƣu hành chủ yếu là vi rút cúm B (74%), sau đó là vi rút cúm A/H1N1 (20,78%). Ngoài ra, các vi rút gây VĐHHC khác nhƣ vi rút họ Picorna (51,28%) và
RSVphân typ B là 10,26% [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lê Khánh Hằng và cộng sự tại Tây Nguyên năm 2003 đã cho thấy 13,9% là chủng vi rút cúm A/H3N2, xuất hiện gần nhƣ quanh năm và cao nhất vào tháng 9. Ngoài ra, các vi rút gây VĐHHC khác nhƣ RSV, hMPV... và các vi rút đƣờng ruột (họ
Picorna) cũng là tác nhân gây viêm đƣờng hô hấp ở Tây Nguyên (18,2%) [4].
Tuy nhiên, những nghiên cứu này dựa vào phƣơng pháp phân lập vi rút trên tế bào cảm thụ nên kết quả phần nào còn hạn chế, phụ thuộc rất nhiều vào chất lƣợng bệnh phẩm, chƣa phản ánh đƣợc đầy đủ tỷ lệ lƣu hành của các loại vi rút gây VĐHHC.
Năm 2007-2008, nhóm nghiên cứu về vi rút gây bệnh VĐHHC ở trẻ em (< 5 tuổi) tại miền Trung Việt Nam bằng phƣơng pháp RT-PCR đa mồi (multiplex RT-PCR) cho thấy căn nguyên chính là vi rút Rhino (28%), RSV (23%), vi rút cúm (15%), hMPV (4,5%), vi rút á cúm (5%) [140]. Tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng, Ngô Hƣơng Giang và cộng sự cũng đã xác định
có 9 tác nhân vi rút gây VĐHHC của các bệnh nhân tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2007-2009. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi rút thuộc họ
Picorna là tác nhân gây bệnh có tỷ lệ cao nhất (36,84%), vi rút cúm A/H3N2
cũng là tác nhân của 30,92% các trƣờng hợp nhiễm bệnh, sau đó là vi rút cúm A/H5N1 chiếm 11,18%, RSV 8,55%, A/H1N1 (7,24%), vi rút cúm B (1,97%), hMPV (1,97%), vi rút Á cúm typ 3 (1,32%) [1].
Nghiên cứu tại nhóm trẻ em nhỏ dƣới 6 tháng tuổi và 7-12 tháng tuổi điều trị tại một số tỉnh miền Nam, 2009-2013 cho thấy tỷ lệ VĐHHC chiếm phần lớn ở trẻ sơ sinh. Tỷ lệ nằm viện do VĐHHC là 81/1000 và 138/1000 trẻ trong đó các vi rút đƣợc phát hiện thƣờng xuyên là Rhino, RSV, cúm A và
Bocavirus [15].
Nghiên cứu dịch tễ học phân tử RSV trên đối tƣợng trẻ nhỏ dƣới 15 tuổi nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính nhập viện Nhi Đồng 2, thành phố Hồ Chí Minh (tháng 4/2010 – tháng 5/2011) cho thấy RSV-A và RSV-B lƣu hành đồng thời, trong đó RSV-A (91,4%) là căn nguyên chủ yếu gây dịch RSV trong giai đoạn nghiên cứu. RSV-A thuộc genotyp GA2, là genotyp phổ biến trên thế giới và tồn tại rất nhiều năm. RSV-B thuộc genotyp BA (BA9 và BA10), là 2 genotyp đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên thế giới tại Nhật Bản năm 2006. Nhiễm RSV-A có biểu hiện lâm sàng nặng hơn so với nhiễm RSV- B. Sự đồng nhiễm 2 typ vi rút RSV không ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện bệnh [119].
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÕNG THÍ NGHIỆM DÙNG TRONG CHẨN ĐỐN TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP
Đặc điểm dịch tễ và các biểu hiện lâm sàng của VĐHHC nhƣ thời điểm nhiễm, tiền sử phơi nhiễm, và một số dấu hiệu chỉ điểm nhƣ ban, viêm kết mạc… rất có giá trị trong định hƣớng tới một số tác nhân vi rút nhƣ sởi,
Adeno. Tuy nhiên, việc chẩn đoán chính xác các tác nhân gây bệnh phải sử dụng các phƣơng pháp chẩn đốn đặc hiệu trong phịng thí nghiệm.
Chẩn đốn đặc hiệu nói chung phụ thuộc vào phƣơng pháp áp dụng và loại bệnh phẩm phù hợp. Nhiều loại vi rút có thể phân lập đƣợc ở bệnh phẩm thu thập tại đƣờng hô hấp trên: dịch hầu họng, dịch mũi, dịch họng, nƣớc súc họng. . . ,tuy nhiên bệnh phẩm từ đƣờng hơ hấp dƣới thƣờng sẽ có nồng độ vi rút cao hơn, đặc biệt ở ngƣời lớn hoặc các trƣờng hợp suy giảm miễn dịch.
1.3.1. Xét nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest)
Đây là một xét nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên của vi rút, kháng thể đơn dịng có trong que thử kết hợp với kháng nguyên của vi rút: vi rút cúm, vi rút hợp bào đƣờng hô hấp (RSV), vi rút Adeno, vi rút Corona. Việc sử dụng xét nghiệm nhanh rất có hiệu quả trong việc xác định sớm các ổ dịch trong cộng đồng, trƣờng học, khách du lịch… để có biện pháp can thiệp kịp thời. Ƣu điểm của kỹ thuật là nhanh, đơn giản và dễ thực hiện, trong vịng 5-30 phút có kết quả. Chẩn đoán cúm dựa trên dấu hiệu lâm sàng (sốt, ho, đau họng…) cho kết quả với độ nhạy là 64% và độ đặc hiệu là 67% [21, 95].
+ Thử nghiệm chẩn đoán nhanh đối với vi rút cúm: có nhiều sinh phẩm chẩn đốn nhanh, trong đó có một số sản phẩm của Nhật Bản và Hoa Kỳ sản xuất, tuy nhiên, độ nhạy của mỗi loại sinh phẩm cũng rất khác nhau (10-80%) [43, 136]: Directigen Flu A + B, FLU OIA A/B, XPECT FLU A/B, NOW FLU A/B, Capilia Flu A/B, Quick Vue Influenza Test…
+ Thử nghiệm chẩn đốn nhanh đối với các vi rút hơ hấp khác: Quick Vue RSV10 Test, RAM@RSV Test, QuickStripe Adeno/Rota, Adeno-Strip…
1.3.2. Phân lập vi rút
Phân lập vi rút đƣợc coi là ―tiêu chuẩn vàng‖ trong giám sát vi rút nói chung [24]. Chủng vi rút phân lập trong vụ dịch đƣợc nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng ngun để có
thể dự báo đƣợc sự lan truyền của một chủng vi rút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin. Mỗi loại vi rút sẽ thích ứng với một/một số dịng tế bào cảm thụ đặc trƣng. Hiện nay,các dòng tế bào cảm thụ cho vi rút cúm và các vi rút hô hấp thƣờng là MDCK, HEp-2, A549, LLC-MK2 [64, 87, 138].
*Phân lập vi rút cúm
Hiện nay có 2 hệ thống phân lập đƣợc TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà có phơi 10-11 ngày tuổi đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogen Free – SPF) và trên dịng tế bào thận chó thƣờng trực (Mardin – Darby canine kidney cells – MDCK).
Ƣu điểm của việc phân lập vi rút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân lập đƣợc một số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, tùy theo mục đích nghiên cứu để chọn lựa phƣơng pháp phân lập. Phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ƣu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lƣợng lớn vi rút với hiệu giá cao.
*Phân lập vi rút hô hấp khác
Mỗi loại vi rút có khả năng nhân lên trên một/một số dịng tế bào cảm thụ nhất định nhƣ vi rút Adeno có khả năng nhân lên trên tế bào HEp-2, A459 hay Vero trong đó dịng tế bào A549 là dịng tế bào thích hợp nhất để phân lập vi rút Adeno. Vi rút RSV, PIV có khả năng nhân lên tốt trên dòng tế bào HEp-2. Vi rút hMPV thích hợp trên dịng tế bào LLC-MK2. Sự xuất hiện hiện tƣợng huỷ hoại tế bào (CPE) đƣợc quan sát rõ nhất khi phân lập vi rút Adeno; với các vi rút RSV, hMPV, PIV thời gian phân lập thƣờng kéo dài 10-14 ngày và sự xuất hiện huỷ hoại tế bào (CPE) là rất khó quan sát [64].
1.3.3. Phản ứng Realtime PCR/ RT-PCR
Phƣơng pháp Realtime PCR/RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang cho phép phát hiện
chính xác số bản sao ADN, ARN (định lƣợng) của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật [32, 39, 85].
- Mẫu dò là một đoạn oliognucleotit (vd: Taqman probe) đƣợc gắn với một chất nhuộm phát tín hiệu huỳnh quang ở đầu 5’ (R), đầu kia thì đƣợc gắn với thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang (Q). Khi mẫu dị cịn ngun vẹn, Q có vai trị nhận năng lƣợng phát ra từ R (hiệu ứng chuyển năng lƣợng huỳnh quang). Nếu có trình tự đích, mẫu dị và mồi sẽ gắn vào khn, q trình tổng hợp bắt đầu. Trong quá trình tổng hợp, enzym Taq DNA polymerase với hoạt tính exonuclease sẽ cắt các nucleotid của mẫu dị từ đầu 5’, giải phóng R khỏi Q, làm tăng tín hiệu huỳnh quang của R. Càng nhiều sản phẩm tạo thành thì càng nhiều mẫu dị bị phân cắt và tín hiệu của R phát ra càng nhiều. Mắt đọc tín hiệu huỳnh quang của máy sẽ thu tín hiệu R, xử lý bằng phần mềm và đƣa ra kết quả cuối cùng.
Hình 1. 16: Phân tích Real time RT-PCR
(Tín hiệu huỳnh quang FAM thu nhận tại bƣớc sóng 520nm)
Ƣu điểm của phƣơng pháp: nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết đƣợc lƣợng ADN đã tạo thành ở từng thời điểm; độ nhạy, độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm.
Nghiên cứu tại Braxin năm 2009, phƣơng pháp Realtime RT-PCR đa mồi đã đƣợc áp dụng để xác định các tác nhân hô hấp nhƣ cúm và RSV [32], Nghiên cứu tại Anh năm 2005 cũng áp dụng phƣơng pháp Realtime RT-PCR phát hiện RSV và hMPV, 4 phản ứng Realtime RT-PCR đa mồi có khả năng phát hiện 12 tác nhân vi rút hô hấp [49] hay quy trình phát hiện 14 tác nhân hơ hấp của CDC- Hoa Kỳ. Nghiên cứu so sánh trên 250 mẫu tỵ hầu thu thập năm 2010 tại Brazil cho thấy Realtime RT-PCR phát hiện 128/250 (51,2%) dƣơng tính với RSV so với 86/250 (34,3%) khi xác định bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (IFA),Tƣơng tự nhƣ vậy, tỷ lệ phát hiện vi rút cúm B bằng Realtime RT-PCR (3,6%) cao hơn so với IFA (1,2%), và phƣơng pháp Realtime RT-PCR có khả năng xác định đồng nhiễm vi rút cúm và RSV, hoặc RSV/A vàRSV/B trong khi IFA không xác định đƣợc. Tỷ lệ phát hiện tác nhân vi rút RSV bằng Realtime RT-PCR cũng cao hơn IFA trong nghiên cứu tại Hoa Kỳ năm 2010 [59]. Tại Ấn Độ, nghiên cứu của Malhotra B và cộng sự (2016) trên 155 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ viêm đƣờng hô hấp cấp ở trẻ em dƣới 5 tuổi. Kết quả phân lập và áp dụng phƣơng pháp Realtime RT-PCR phát hiện đƣợc các căn nguyên vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp A/H1N1pdm09, Adeno, hMPV [73].
1.3.4. Kỹ thuật Luminex/xTAG RVP
Tác nhân vi rút gây VĐHHC đƣợc xác định rất lớn (trên 200 loại), để đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm, chính xác nhiều loại tác nhân vi rút gây VĐHHC trong cùng một phản ứng, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc thiết kế: RT- PCR đa mồi, Realtime RT-PCR đa mồi và Luminex/xTAG đã đƣợc phát triển. Luminex/xTAG có khả năng phát hiện nhanh nhiều loại vi rút và phân typ (18 tác nhân vi rút khác nhau) cúm A, cúm A/H1N1, cúm A/H3N2, cúm B, RSV, hMPV, Para 1, 2, 3, 4, vi rút Entero – vi rút Rhino, vi rút Corona và