Kết quả Bảng 3.5, Hình 3.3 cho thấy có 8 loại vi rút đƣợc phát hiện
Vi rút Năm Tổng số (n) Tỷ lệ (%) 2013 2014 2015 2016 A/H1pdm09 74 37 4 28 143 45,1 A/H3 15 19 21 14 69 21,8 Cúm B 11 7 3 7 28 8,8 A/H1pdm09+ B 0 1 0 0 1 0,3 hMPV 1 4 0 2 7 2,2 RSV 0 1 0 2 3 1 Á cúm typ 3 2 2 3 1 8 2,5 Rhino 19 12 7 4 42 13, 2 Adeno 6 5 0 5 16 5,1 Tổng 128 88 38 63 317 100. 0
A/H1pdm09, A/H3N2, B (V/Y), hMPV, RSV, Adeno, Rhino, hMPV. Trong đó, vi rút cúm A/H1pdm09 chiếm ƣu thế với tỷ lệ cao nhất trong các tác nhân vi rút gây VĐHHC (45,1%), tiếp sau là vi rút cúm A/H3 (21,8%), Rhino (13,2%), vi rút cúm B (8,8%), các vi rút khác hMPV, RSV, á cúm typ 3 và Adeno đƣợc xác định với tỷ lệ dao động từ 1,0 (RSV) đến 5,1% (Adeno). Đồng thời, trong nghiên cứu cũng xác định đƣợc 1 trƣờng hợp đồng nhiễm giữa vi rút cúm A/H1pdm09 và cúm B (0,3%).
Kết quả Bảng 3.5 cũng xác định vi rút hMPV, Adeno không đƣợc phát hiện trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân VĐHHC năm 2015 và RSV không xác định trong năm 2013 và 2015. Phân tích cụ thể các tác nhân vi rút đƣợc phát hiện trong nghiên cứu cho thấy vi rút cúm A/H1pdm09 (n=143), vi rút cúm A/H3 (n=69) và Rhino (n=42) là 3 tác nhân vi rút nổi trội và đƣợc xác định trong tất cả các năm nghiên cứu (Bảng 3.5). So sánh giữa các vi rút trong họ Orthomyxoviridae, vi rút cúm A/H1pdm09 đƣợc xác định nổi trội trong
các năm 2013, 2014 và 2016 trong khi vi rút cúm A/H3 chiếm ƣu thế năm 2015 và vi rút cúm B có một tỷ lệ ổn định trong tồn bộ các năm nghiên cứu (Bảng 3.5). Kết quả này phù hợp với kết quả giám sát cúm khi vi rút cúm A/H3 nổi trội năm 2015 và vi rút cúm A/H1pdm09 chiếm ƣu thế các năm cịn lại (số liệu chƣa cơng bố).
Cũng giống nhƣ phần lớn các nghiên cứu trên thế giới, vai trò của từng phân typ vi rút cúm trong VĐHHC chƣa đƣợc xác định rõ ràng trong nghiên cứu của chúng tôi [40, 44, 76, 78, 92, 141]. Tuy nhiên, sự tiến hoá của vi rút cúm A với các hiện tƣợng trôi, trƣợt kháng nguyên, sự trao đổi và tích hợp sẽ là những nguy cơ tạo các đột biến tăng nặng của bệnh (D222G trên protein HA của vi rút cúmA/H1pdm09) [38, 113, 118, 123]. Vì vậy, phân tích sâu về sinh bệnh học và vi rút học các tác nhân vi rút cúm là cần thiết trong các nghiên cứu tiếp theo.
Rhino, Corona, RSV và á cúm là những vi rút đƣợc ghi nhận là tác nhân gây hội chứng cảm cúm thông thƣờng trong đó Rhino là tác nhân thƣờng gặp nhất. Vi rút Rhino thuộc họ Picornaviridae và thƣờng đƣợc phát
hiện tại đƣờng hô hấp trên và gây những triệu chứng lâm sàng nhẹ: hắt hơi, sổ mũi, ho…Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy vi rút Rhino đƣợc phát định với số dƣơng tính cao thứ 3 (13,2%) sau vi rút cúm A/H1pdm09 và A/H3 (Bảng 3.5). Kết quả trên cho thấy nhiễm vi rút Rhino có thể xuất hiện các triệu chứng lâm sàng đa dạng: khơng có triệu chứng, biểu hiện nhẹ đến nặng yêu cầu điều trị tại bệnh viện (VĐHHC) [18, 90, 98]. Vi rút Rhino thƣờng đƣợc xác định đồng nhiễm với các vi rút đƣờng hô hấp khác trong bệnh nhân VĐHHC [92, 104]. Vi rút này đƣợc cho là vi rút lành tính, lƣu trú thƣờng xuyên tại đƣờng hô hấp trên. Tuy nhiên trong nghiên cứu này của chúng tôi, không phát hiện đồng nhiễm của vi rút Rhino với các vi rút khác, điều này có thể khẳng định rằng vi rút Rhino là tác nhân gây của VĐHHC. Sự tăng nặng của nhiễm vi rút Rhino thƣờng liên quan đến phân typ Rhino typ C trong khi Rhino typ A và B gây biểu hiện lâm sàng nhẹ [18]. Trong nghiên cứu này, chƣa xác định các phân typ của vi rút Rhino, vì vậy việc xác định rõ sự liên quan về di truyền học và bệnh cảnh lâm sàng cần đƣợc tiến hành trong tƣơng lai để có thể đƣa ra các cảnh báo trong cơng tác điều trị và dự phịng. 3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VI RÚT CÚM
Vi rút cúm họ Orthomyxovidae là tác nhân chính của VĐHHC và
chiếm tỷ lệ 76% trong tổng số các vi rút gây bệnh (Bảng 3.4), trong đó vi rút cúm A/H1pdm09 lƣu hành nổi trội với tỷ lệ 45,1% và cúm A/H3 đạt tỷ lệ 21,8% (Bảng 3.5). Do sự tiến hoá của vi rút cúm diễn ra thƣờng xuyên (đặc biệt với vi rút cúm A) thông qua các sự thay đổi về di truyền học, đặc tính kháng nguyên mà hậu quả là sự xuất hiện các phân typ mới, dẫn tới nguy cơ
bùng phát đại dịch [17, 106]. Với lý do đó, việc giám sát về vi rút học đƣợc yêu cầu cho phần lớn các nghiên cứu có liên quan là hết sức cần thiết.
Trong nghiên cứu này, đặc điểm di truyền và các yếu tố liên quan của vi rút cúm đƣợc phân tích bằng giải trình tự phân đoạn gen HA và NA. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm cũng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ức chế ngƣng kết hồng cầu (HAI) theo thƣờng quy của Trung tâm Cúm quốc gia, khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng trên cơ sở các vi rút cúm đƣợc phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng từ bệnh nhân VĐHHC.
3.3.1. Kết quả phân lập và định typ vi rút cúm, 2013-2016
Trong tổng 241 mẫu bệnh phẩm lâm sàng VĐHHC dƣơng tính qua phát hiện bằng Realtime RT-PCR với vi rút cúm đã đƣợc phân lập trên tế bào MDCK và thu đƣợc 121 vi rút đạt tỷ lệ 50,2%. Tỷ lệ phân lập dao động từ 40% (năm 2013) đến 59,3% (năm 2014) (Bảng 3.6).
Bảng 3. 6. Kết quả phân lập vi rút cúm năm 2013-2016
Năm Tổng số mẫu Realtime RT- PCR (+) (N)
Số mẫu phân lập dƣơng tính theo phân typ
Tổng số chủng (n) Tỉ lệ % mẫu phân lập (n/N) H1pdm09 H3 Cúm B 2013 100 36 2 2 40 40,0 2014 64 24 11 3 38 59,3 2015 28 0 14 1 15 53,5 2016 49 18 8 2 28 57,1 Tổng số 241 78 35 8 121 50,2
Trong tổng số 121 mẫu vi rút phân lập đƣợc trong nghiên cứu (Bảng 3.6) có 78 vi rút cúm A/H1N1pdm09, 35 vi rút cúm A/H3N2 và 8 vi rút cúm B đạt tỷ lệ 50,2% trong tổng số mẫu xác định dƣơng tính bằng phản ứng Realtime RT-PCR. Trái lại, kết quả phân lập vi rút dƣơng tính theo phân typ thu thập đƣợc trong năm 2015 khơng thấy sự có mặt của vi rút cúm A/H1N1pdm09 do số bệnh phẩm dƣơng tính quá thấp (4 bệnh phẩm). Vì vậy, việc phân lập vi rút từ bệnh phẩm lâm sàng đã không thành công (Bảng 3.5; 3. 6).
3.3.2. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA và NA của vi rút cúm A/H1N1pdm09 phân lập từ bệnh nhân viêm đƣờng hô hấp cấp, 2013- 2016
70/78 vi rút cúm A/H1N1pdm09 đƣợc phân lập trong giai đoạn nghiên cứu, giải trình tự nucleotide và phân tích đặc điểm di truyền đƣợc tiến hành tại các năm 2013, 2014 và 2016. Vì lý do năm 2015 không phân lập đƣợc vi rút cúm A/H1N1pdm09 từ bệnh phẩm lâm sàng (Bảng 3.6).
Cây gia hệ đƣợc xây dựng bằng phần mềm Neibourgh joining (NJ) cho thấy vi rút cúm A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu thuộc nhóm 6B và 6C (vi rút lƣu hành năm 2013) có tƣơng đồng cao với các vi rút lƣu hành tại các nƣớc (Hình 3.4, 3. 5).
Vi rút thuộc nhóm 6B đƣợc phân thành 3 nhóm phụ: 6B, 6B1 và 6B2, các vi rút phân lập năm 2014 và 2016 phần lớn nằm trong nhóm 6B1 và 6B2 tƣơng đồng với vi rút đại diện A/Michigan/45/2015 (6B1) và A/Iowa/53/2015 (6B2) (Hình 3.6).
Hình 3. 4. Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1778 nucleotide của vi rút cúm A/H1N1pdm09, 2013-2016
(Phương pháp Neibourgh joining với giá trị boostrap >70%, chủng A/California/7/2009 được sử dụng làm chủng chuẩn để so sánh)
2013 2015 2016
Hình 3. 5. Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1413 nucleotide của vi rút cúm A/H1N1pdm09, 2013-2016
(Phương pháp Neibourgh joining với giá trị boostrap >70%, chủng
2013 2015 2016
Kết quả phân tích gia hệ phân đoạn gen HA và NA vi rút cúm A/H1N1pdm09 lƣu hành năm 2013, 2014 và 2016 cho thấy vi rút cúm A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu phần lớn tập trung trong nhóm 6B và 6C (Hình 3.4; Hình 3.5). Từ khi lần đầu tiên xuất hiện tại Mexico vào tháng 3 năm 2009, vi rút cúm A/H1N1pdm09 đã trở thành vi rút cúm mùa và lƣu hành rộng rãi trên phạm vi toàn cầu, đến thời điểm hiện tại kết quả phân tích di truyền quần thể vi rút cúm A/H1N1pdm09 có thể phân chia thành 9 nhóm gen chính, cho dù hiện tại chỉ có nhóm 5 đến nhóm 9 là các nhóm đang lƣu hành. Các nhóm này thƣờng phân bố và tập trung theo khu vực địa lý, nhóm 6 là nhóm vi rút lớn nhất hiện tại và lƣu hành rộng rãi nhất trên phạm vi tồn cầu, trong khi các nhóm khác chỉ xuất hiện tại một số khu vực đơn lẻ, nhóm 9 lƣu hành tại châu Phi, nhóm 8 lƣu hành tại châu Phi và một số nƣớc châu Âu… Nhƣ vậy, vi rút cúm A/H1N1pdm09 phân lập tại miền Bắc Việt Nam thuộc nhóm phổ biến và chiếm ƣu thế trong giai đoạn nghiên cứu. Kết quả trên cho thấy sự thuận lợi trong cơng tác phịng bệnh bằng vắc xin tại Việt Nam khi vi rút vắc xin dự tuyển sẽ đƣợc lựa chọn theo tiêu chí đầu tiên là sự phổ biến trên phạm vi tồn cầu.
Phân tích sâu hơn về sự tiến hoá di truyền của vi rút cúm A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu thơng qua phân tích gia hệ từng năm 2013, 2014 và 2016 bằng thuật toán Neighbor - Joining có thể xác định nhanh các liên quan giữa các trình tự chuỗi nucleotide bằng sự khác biệt về khoảng cách giữa các nhóm [17]. Kết quả nghiên cứu cho thấy: các vi rút A/H1N1pdm09 lƣu hành trong năm 2014, 2016 nằm tập trung trong nhóm 6B (phân nhóm 6B1và 6B2), và vi rút lƣu hành năm 2013 nằm trong nhóm 6C (Hình 3.6). Sự khác biệt này đƣợc ghi nhận khi phân tích protein HA với số lƣợng và vị trí thay đổi của các axit amin (Bảng 3.7).
Hình 3. 6. Phân tích gia hệ nhóm 6 vi rút cúm A/H1N1pdm09 lƣu hành tại miền Bắc, 2013-2016
Phân tích protein HA các vi rút A/H1N1pdm09 lƣu hành tại Việt Nam tại nhóm 6 đƣợc tiến hành khi so sánh với vi rút gốc (vắc xin) A/California/07/2009 và các vi rút đại diện của các nhóm/ nhóm phụ.
Nhóm 6 đại diện bởi các vi rút có cùng sự thay đổi axit amin tại các vị trí D97N, S185T, S203T, E374K và S451N trên protein HA so với vi rút gốc A/California/07/2009. Các nhóm phụ 6A, 6B, 6B1, 6B2, 6C cũng đƣợc phân tách theo một số thay đổi axit amin. Phần lớn các vi rút A/H1N1pdm09 lƣu hành năm 2013 trên thế giới thuộc nhóm 6, các vi rút lƣu hành tại Bắc bán cầu năm 2014-2015 tập trung chủ yếu vào nhóm 6B và các vi rút lƣu hành năm 2016 tập trung tại nhóm 6B1 (Bảng 3.7, Hình 3.6).
Bảng 3. 7. Sự thay đổi các axit amin trong nhóm 6 của các vi rút A/H1N1pdm09 lƣu hành tại miền Bắc, 2013-2016
Nhóm/ nhóm phụ Năm phân lập
Các vị trí aa thay đổi so với vi rút gốc A/California/07/09
Vi rút đại diện cùng
nhóm 6B 2014 P83S, D97N, K163Q, S185T, S203T,
E224E/G, A256T, K283E, I321V, E374K. A/North Carolina/ 04/2014 2016 S451N, I460T, N473D, E499K 6B1 2016 P83S, S84N, D97N, S162N, K163Q, S185T, S203T, I216T, A256T, K283E, I321V, E374K, S451N, E499K
A/Michigan/ 45/2015
6B2 2016 P83S, D97N, V152T, K163Q, V173I, S185T, S203T, A256T, A261S, K283E, I321V, E374K, S451N, E491G, E499K, D501
A/Iowa/ 53/2015
6C 2013 K43R, S71Y, P83S, D97N, I116M,
S185T, S203T, R205K, K209K/N, V234I, M257V, K283E, I286V,I321V, E374K, S451N, E499K
A/Dominica n Republic/ 7293/2013
Tƣơng tự, phân tích và so sánh trình tự protein NA với vi rút gốc A/California/07/09, kết quả cho thấy không phát hiện các sự thay đổi quan trọng liên quan đến giảm nhạy cảm với Oseltamivir (H275) trong vi rút cúm A/H1N1pdm09 [6] và không ghi nhận đột biến này trong nhóm bệnh nhân cúm điều trị tại bệnh viện. Các nghiên cứu khác trên thế giới cũng cho thấy đột biến H275Y xuất hiện hạn chế, chƣa lan rộng trong cộng đồng. Kết quả của chúng tơi đã cập nhật các kết quả đã có tại Việt Nam và bổ sung dữ liệu về giám sát kháng Oseltamivir cho hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISS), điều này cho thấy sử dụng Oseltamivir trong điều trị cúm vẫn là phƣơng pháp điều trị đặc hiệu hiện nay.
3.3.3. Đặc điểm di truyền của phân đoạn gen HA, NA của vi rút cúm A/H3N2 phân lập từ bệnh nhân VĐHHC, 2013-2016 A/H3N2 phân lập từ bệnh nhân VĐHHC, 2013-2016
Tổng số 35 vi rút cúm A/H3N2 đƣợc sử dụng trong phân tích với số lƣợng các năm khác nhau: 2013 (n=2); 2014 (n=11); 2015 (n=14) và 2016 (n=8), đƣợc so sánh gia hệ vớí các vi rút trong khu vực và các vi rút đại diện cho năm (vi rút vắc xin dự tuyển). Trong giai đoạn 2013-2106, TCTYTG khuyến cáo sử dụng vi rút A/H3N2 dự tuyển cho khu vực Bắc Bán cầu nhƣ sau:
Mùa 2013-2014: A/Victoria/361/2011 hoặc A/Texas/50/2012 Mùa 2014-2015: A/Texas/50/2012
Mùa 2015-2016: A/Swizeland/915293/2013
Kết quả trình tự phân đoạn gen đƣợc phân tích gia hệ bằng thuật tốn Neibour Joining (NJ) và so sánh với vi rút vắc xin A/Perth/16/2009.
Hình 3. 7. Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1184 nucleotide của vi rút cúm A/H3N2, 2013-2016
(Phương pháp Neibourgh joining với giá trị boostrap >70%, chủng
A/Perth/16/2009 và A/Switzerland/9715293/2013 được sử dụng làm chủng chuẩn để so sánh)
2013 2015 2016
Hình 3. 8. Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1455 nucleotide của vi rút cúm A/H3N2, 2013-2016
(Phương pháp Neibourgh joining với giá trị boostrap >70%, chủng A/Perth/16/2009 và A/Switzerland/9715293/2013
được sử dụng làm chủng chuẩn để so sánh)
2013 2015 2016
2013 2014
2015 2016
Cây gia hệ vi rút cúm A/H3N2 đƣợc chia thành 7 nhóm, trong đó nhóm 3C xuất hiện và trở thành phổ biến trên thế giới từ năm 2013 và phân tách các nhóm 3C.1; 3C.2 và 3C.3. Đến năm 2014, một số hiện tƣợng trôi, trƣợt kháng nguyên xảy ra, các vi rút cúm A/H3N2 biến thể xuất hiện tại nhóm 3C.2 và 3C.3, nên phân tách thành các nhóm phụ 3C.2a; 3C.2b với sự thay đổi của axit amin tại vị trí L3I, N144S, N225D và Q311H trên protein HA. Đến năm 2016, phần lớn các vi rút nhóm 3C.2a xuất hiện sự thay đổi axit amin tại vị trí N171K; I406V và G484E tạo ra nhóm phụ mới là 3C.2a1.
Sự tiến hoá của vi rút cúm A/H3N2 lƣu hành tại Việt Nam đƣợc ghi nhận trong phân tích gia hệ (Hình 3.7) và cụ thể nhƣ sau:
Bảng 3. 8. Nhóm/ phân nhóm trên cây gia hệ của vi rút cúm A/H3N2 lƣu hành tại miền Bắc, 2013-2016
Năm lƣu hành Nhóm/ phân nhóm Vi rút vắc xin dự tuyển 2013 3B; 3C.2; 3C.3 A/Victoria/361/2011
2014 3C.3a A/Texas/50/2012
2015 3C.2a; 3C.3a A/Texas/50/2012
2016 3C.2a; 3C.2a1 A/Switzerland/9715293/2013 Kết quả Bảng 3.8, Hình 3.7, cho thấy trong giai đoạn nghiên cứu vi rút cúm A/H3N2 đã phân tách thành 6 nhóm/ phân nhóm và có sự tƣơng đồng với chủng vắc xin dự tuyển 92% (năm 2013), 94% (năm 2014-2015) và 92,8% (năm 2016). Tƣơng tự, cây gia hệ phân đoạn gen NA cho thấy các vi rút A/H3N2 trong nghiên cứu lƣu hành năm 2013 nằm trong nhóm 3A, năm 2014 và 2015 tập trung chủ yếu trong phân nhóm 3C.2a với độ tƣơng đồng đạt 96,1% (Hình 3.8).
Nghiên cứu của chúng tơi đã sử dụng các trình tự phân đoạn gen HA và NA của các vi rút vắc xin dự tuyển cho khu vực Bắc bán cầu trong giai đoạn nhiên cứu (A/Victoria/361/2011; A/Texas/50/2012 và A/Swizeland/915293/2013) làm vi rút đại diện để so sánh với các vi rút phân lập đƣợc trong nghiên cứu của chúng tơi khi phân tích gia hệ từ đó có thể xác định rõ xu hƣớng tiến hoá của vi rút cúm A/H3N2 lƣu hành tại Việt Nam so với các vi rút lƣu hành trên thế giới.
Kết quả phân tích gia hệ phân đoạn gen HA và NA cho thấy các vi rút cúm A/H3N2 thu đƣợc trong nghiên cứu thuộc nhóm 3 và nhóm trong các phân nhóm chính 3B hoăc 3C (Hình 3.7; 3.8). Tại các phân nhóm 3B và 3C các phân nhóm phụ cũng đƣợc ghi nhận và thay đổi theo các năm lƣu hành: 3B, 3C.2, 3C.3(2013); 3C.3a (2014); 3C.2a, 3C.3a (2015) và 3C.2a; 3C.2a1 (2016). Kết quả trên cho thấy sự thay đổi nhanh về mặt di truyền học của phân đoạn gen HA của vi rút cúm A/H3N2.