CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR
Phƣơng pháp Realtime RT-PCR áp dụng trong luận án đƣợc thực hiện theo quy trình của Trung tâm Kiểm sốt và phịng ngừa bệnh tật (CDC- Hoa Kỳ), áp dụng trên hệ thống giám sát các vi rút hô hấp tại Việt Nam đƣợc thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, Viện Pasteur Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên và Viện Pasteur Nha Trang [22, 23, 34, 66, 99, 134, 137].
Phƣơng pháp Realtime RT-PCR thực hiện theo từng tác nhân riêng biệt (single realtime RT-PCR). Để xác định 12 tác nhân, nghiên cứu thực hiện 12 phản ứng riêng biệt, trong đó tác nhân cúm (A/H1pdm09, A/H3, A/H5, A/H7 và B – Victoria/Yamagata) chạy cùng một chu kỳ, 7 tác nhân vi rút hô hấp còn lại (hMPV, RSV, PIV1, PIV2, PIV3, Rhino và Adeno) chạy cùng một chu kỳ.
2.4.1.1. Tách chiết ARN
Nguyên lý
ARN tổng số đƣợc tách từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm vi rút. Sau đó, ARN đƣợc cho vào hỗn hợp RT-PCR với mồi đặc hiệu với từng loại vi rút VĐHHC. ARN có thể đƣợc tách chiết từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng hoặc từ dịch nổi nuôi cấy tế bào. Mẫu bệnh phẩm lâm sàng bao gồm: dịch tỵ hầu, dịch họng, dịch mũi…
Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng QIAGEN (CHLB Đức) để tách chiết ARN của vi rút. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc đánh giá là phƣơng pháp lý tƣởng nhất để tách chiết ARN từ vi rút.
Các bƣớc tiến hành: Theo quy trình thƣờng qui của bộ sinh phẩm
1. Trộn đều 140 l mẫu thử (dịch mũi họng, dịch súc họng, dịch nổi nuôi tế bào…) với 560 l đệm AVL. Để 10 phút.
2. Thêm 560l ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, trộn đều.
3. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm 2ml sạch. Tách 630 l hỗn dịch vào cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm. Lặp lại (3).
4. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
5. Tiếp tục rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/phút/ 3 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
6. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch. Cho 60 l nƣớc cất tinh khiết, ủ 2 phút, ly tâm 8000 vòng/phút/ 1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin. Phần dung dịch thu đƣợc trong ống ly tâm chính là ARN của vi rút.
7. Bảo quản tại -20ºC hoặc -80ºC.
2.4.1.2. Phản ứng Realtime RT-PCR
Sử dụng sinh phẩm SuperScripTM III RT/Platium Taq Mix với các cặp mồi và probe. Sản phẩm PCR khuếch đại sẽ xuất hiện/khơng xuất hiện tín hiệu huỳnh quang.
*Hỗn hợp sinh phẩm Thành phần Thể tích (ul)/ 1 phản ứng Số lƣợng phản ứng (N) 2x PCR master mix 12,5 12,5xN
SuperScrip III RT/Platium Taq Mix 0,5 0,5xN
Mồi xuôi* 0,5 0,5xN Mồi ngƣợc* 0,5 0,5xN Probe 0,5 0,5xN Nƣớc tinh sạch 5,5 5,5xN Tổng số 20 20xN * Sử dụng hệ thống mồi theo Bảng 2.2 và 2.3
* Cho ARN mẫu: ARN bệnh phẩm, chứng âm tách chiết, chứng âm: 5ul ARN. * Cài đặt chương trình trên máy
Tác nhân cúm (A/H1pdm09, A/H3, A/H5, A/H7 và B – Victoria/Yamagata)
Tăng nhiệt trƣớc phản ứng 60ºC /5 phút
RT Bƣớc 1 50ºC /30 phút
Ức chế hoạt hoá Taq Bƣớc 2 95ºC /02 phút
PCR 45 chu kỳ
Bƣớc 3 95ºC /15 giây Bƣớc 4 55ºC /30 giây
Bƣớc 5 Thu nhận tín hiệu huỳnh quang (FAM) Tác nhân vi rút hô hấp khác (hMPV, RSV, PIV1, PIV2, PIV3, Rhino và Adeno)
Tăng nhiệt trƣớc phản ứng 60ºC /5 phút
RT Bƣớc 1 50ºC /30 phút
Ức chế hoạt hoá Taq Bƣớc 2 95ºC /02 phút
PCR 45 chu kỳ
Bƣớc 3 95ºC /15 giây Bƣớc 4 55ºC /1 phút
Bƣớc 5 Thu nhận tín hiệu huỳnh quang (FAM)
*Phân tích kết quả: Tín hiệu huỳnh quang FAM thu nhận tại bƣớc sóng 520nm
Chứng âm phản ứng và chứng âm tách chiết: khơng có tín hiệu huỳnh quang.
Mẫu dƣơng tính: tín hiệu huỳnh quang đƣợc thu nhận trƣớc hoặc tại chu kỳ thứ 40 của phản ứng.
2.4.2. Phân lập vi rút Nguyên lý Nguyên lý
- Vi rút cúm và vi rút đƣờng hơ hấp khác có thể phân lập trên dịng tế bào LLC-MK2, HEp-2 và A549, MDCK/ MDCK-SIAT1.
- Quan sát sự có mặt của các vi rút hơ hấp trong tế bào dựa trên sự thay đổi hình dạng tế bào (sự huỷ hoại tế bào – CPE) hoặc phản ứng ngƣng kết hồng cầu (HA), phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu (HAI) [87, 127].
* Môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trƣờng nuôi tế bào sạch: D-MEM 10% FBS. Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy vi rút:
Vi rút cúm: D-MEM 2% BSA, 2,5ug/ml trypsin-acetyl hóa Vi rút RSV, hMPV, PIV và Rhino: D-MEM 2% FBS.
*Các bước tiến hành
1. Chọn phiến tế bào 24 giếng MDCK-SIAT1, HEp-2, A549 và LLC- MK2 mọc đẹp 1 lớp.
2. Loại bỏ môi trƣờng phát triển, rửa tế bào 2 lần bằng PBS (-) và 1 lần bằng môi trƣờng D-MEM chứa 2 µg/ml TPCKtrypsin đối với vi rút cúm hoặc D-MEM 2% FBS với các vi rút hô hấp khác.
3. Gây nhiễm 200 µl bệnh phẩm, ủ 37ºC/60 phút.
4. Thêm môi trƣờng nuôi cấy vi rút phù hợp. Ủ 37ºC/ 7-10 ngày. 5. Theo dõi sự hủy hoại tế bào (CPE) hàng ngày. Nếu có CPE:
- Vi rút cúm: xác định hiệu giá vi rút bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gà hoặc chuột lang (HA).
- Vi rút RSV, hMPV, PIV và Rhino: xác định sự hiện diện của vi rút bằng thử nghiệm nhanh (quick test) hoặc bằng Realtime RT-PCR. 6. Thu hoạch vi rút, bảo quản tại -70ºC.
* Khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút
- Các chủng vi rút thu hoạch đƣợc tiến hành khuếch đại trên chai tế bào 75 cm3 mọc đẹp 1 lớp.
- Lựa chọn các chai tế bào xuất hiện CPE từ 72 đến 96 giờ sau khi gây nhiễm.
- Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gà hoặc chuột lang (HA) (đối với vi rút cúm) hoặc thử nghiệm nhanh (quick test)/Realtime RT-PCR với các vi rút khác.
- Thu hoạch và cất giữ tại -70ºC.