CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Định nghĩa bệnh viêm đƣờng hô hấp cấp
Theo Tổ chức Y tế Thế giới 2011 [133].
Các bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi do vi rút có triệu chứng sau:
- Bệnh khởi phát trong vịng 7 ngày. - Sốt cao đột ngột trên 38ºC
- Có ho và/ hoặc khó thở
- Kèm theo ít nhất một trong những triệu chứng sau: Thở nhanh, tổn thƣơng trên X quang phổi; phải hỗ trợ hô hấp.
2.1.2. Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm
Cỡ mẫu: Cỡ mẫu toàn bộ 756 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân viêm đƣờng hô
hấp cấp nghi do vi rút nhập viện theo định nghĩa ca bệnh. (Chi tiết danh sách bệnh nhân có trong Phụ lục 1,2,3,4)
Thời gian: 2013 - 2016.
Địa điểm: Mẫu bệnh phẩm thu thập chủ yếu từ bệnh nhân VĐHHC điều trị tại bệnh viện thuộc khu vực miền Bắc Việt Nam: Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Nhi Trung ƣơng, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ƣơng, Bệnh viện Lao phổi Trung ƣơng, Bệnh viện Saint-Paul…
Nơi thực hiện nghiên cứu : Trung tâm Cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ƣơng. 2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm đƣợc lấy ở những bệnh nhân VĐHHC nghi do vi rút trong vòng 7 ngày kể từ khi khởi bệnh, bảo quản 2-8ºC trong khi vận chuyển tới phịng thí nghiệm. Mẫu bệnh phẩm là dịch họng, dịch nội khí quản…đƣợc bảo quản trong môi trƣờng vận chuyển vi rút và đƣợc chấp nhận khi đạt theo
tiêu chuẩn ISO 15189:2012 của Phịng thí nghiệm Cúm – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
Dịch họng: Đƣa tăm bông vào vùng hầu họng, miết mạnh và quay trịn
tăm bơng tại khu vực 2 amidan và thành sau họng và rút ra theo chuyển động xoay trịn. Đƣa ngay tăm bơng vào ống nhựa đã có sẵn 2-3ml mơi trƣờng bảo quản vi rút.
Dịch nội khí quản: Bệnh nhân khi đang thở máy, đã đƣợc đặt nội khí
quản. Dùng 1 ống hút dịch, đặt theo đƣờng nội khí quản và dùng bơm tiêm hút dịch nội khí quản theo đƣờng ống đã đặt. Cho dịch nội khí quản vào ống nhựa đã có sẵn 2-3ml mơi trƣờng bảo quản vi rút.
2.2.2. Các dòng tế bào đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2. 1. Các dòng tế bào thƣờng trực dùng trong phân lập vi rút cúm và các vi rút hơ hấp khác [64]
STT Dịng tế bào thƣờng trực (continuous cell lines)
Vi rút
1 MDCK-SIAT1 Vi rút cúm (Influenzavirus)
2 HEp-2 Vi rút hợp bào đƣờng hô hấp
(Respiratory Syncytialvirus - RSV) Adenovirus Vi rút á cúm (Parainfluenzavirus-PIV) 3 A549 Adenovirus 4 LLC-MK2 Vi rút á cúm (Parainfluenzavirus) Human metapneumovirus (hMPV)
2.2.3. Sinh phẩm
2.2.3.1. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp Realtime RT-PCR
Hệ thống mồi sử dụng theo thƣờng quy của CDC – Hoa Kỳ.
Bảng 2. 2. Hệ thống mồi và probe sử dụng phát hiện vi rút cúm bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR [7]
Vi rút Mồi và probe Trình tự (5'-3')
Cúm A
Flu A xuôi CAT GGA RTG GCT AAA GAC AAG ACC Flu A ngƣợc AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA
Flu A probe FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG- BHQ1
Phân typ A/H1pdm09
SW H1 xuôi GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA SW H1 ngƣợc CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC
SW H1 probe FAM-CA GAA TAT ACA ―T‖CC RGT CAC AAT TGG ARA A-BHQ1
Phân typ A/H3
H3 HA xuôi AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC H3 HA ngƣợc ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT
H3 HA probe FAM-CAG GAT CAC ATA TGG GSC CTG TCC CAG-BHQ1
Phân typ A/H5
H5 HA xuôi TGG AAA GTG TAA RAA ACG GAA CGT H5 HA ngƣợc TGA TTG CCA GYG CTA GGG AAC T
H5 HA probe FAM-TGA CTA CCC GCA G''T''A TTC AGA AGA AGC AAG ACT AA-BHQ1
Phân typ A/H7 H7 HA xuôi TGTGATGAYGAYTGYATGGCCAG H7 HA ngƣợc ACATGATGCCCCGAAGCTAAAC H7 HA probe FAM-CATYCCATTRTGCTCTGTGTGGAG-BHQ1 Cúm B
Flu B xuôi TCC TCA ACT CAC TCT TCG AGC G Flu B ngƣợc CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG
Flu B probe FAM-CCA ATT CGA GCA GCT GAA ACT GAG GTG-BHQ1
Bảng 2. 3. Hệ thống mồi và probe sử dụng phát hiện vi rút hô hấp khác bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR [25] Vi rút Mồi và probe Trình tự (5'-3') Vi rút Human metapneumo (hMPV)
hMPV xuôi CAA GTG TGA CAT TGC TGA YCT RAA hMPV ngƣợc ACT GCC GCA CAA CAT TTA GRA A
hMPV probe FAM-TGG CYG TYA GCT TCA GTC AAT TCA ACA GA- BHQ1
Vi rút
Respiratory syncytial
(RSV)
RSV xuôi GGC AAA TAT GGA AAC ATA CGT GAA RSV ngƣợc TCT TTT TCT AGG ACA TTG TAY TGA ACA G RSV probe FAM-CTG TGT ATG TGG AGC CTT CGT GAA-
GCT- BHQ1 Vi rút
Parainfluenza 1
(PIV1)
PIV1 xuôi ACA AGT TGT CAA YGT CTT AAT TCR TAT PIV1 ngƣợc TCG GCA CCT AAG TAR TTY TGA GTT
PIV1 probe FAM-ATA GGC CAA AGA "T"TG TTG TCG AGA CTA TTC CAA- BHQ1
Vi rút
Parainfluenza 2
(PIV2)
PIV2 xuôi GCA TTT CCA ATC TAC AGG ACT ATG A PIV2 ngƣợc ACC TCC TGG TAT AGC AGT GAC TGA AC PIV2 probe FAM-CCA TTT ACC "T"AA GTG ATG GAA TCA
ATC GCA AA-BHQ1 Vi rút
Parainfluenza 3
(PIV3)
PIV3 xuôi TGG YTC AAT CTC AAC AAC AAG ATT TAA G PIV3 ngƣợc TAC CCG AGA AAT ATT ATT TTG CC
PIV3 probe FAM-CCC RTC TG"T" TGG ACC AGG GAT ATA CTA CAA A-BHQ1
Vi rút Rhino
Rhi xuôi CY[A] GCC [T]GC GTG GC
Rhi ngƣợc GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA
Rhi probe FAM-TCC TCC GGC CCC TGA ATG YGG C- BHQ1
Vi rút Adeno
Adn xuôi GCC CCA GTG GTC TTA CAT GCA CAT C Adn ngƣợc GCC ACG GTG GGG TTT CTA AAC TT
And probe FAM-TG CAC CAG ACC CGG GCT CAG GTA CTC CGA-BHQ1
Human RNase P control (RNP3)
RNP xuôi CCA AGT GTG AGG GCT GAA AAG
RNP ngƣợc TGT TGT GGC TGA TGA ACT ATA AAA GG RNP probe FAM-CC CCA GTC TCT GTC AGC ACT CCC
Bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, Cat No 52904, Qiagen.
Bộ sinh phẩm SuperScrip III Platium One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen) Cat No. 11732-088.
2.2.3.2. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen
Uni 12 primer (CDC - Mỹ)
PCR Qiagen proof start kit (Cat no 202203).
Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR: Purification kit Qiaquick 250, Cat. No. 28106, Qiagen.
Bộ sinh phẩm cho chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle sequencing): BigDye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing kit P/N: 4336917, ABI.
Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide: DyeEx 2.0 Spin kit, Cat. No. 63206, Qiagen.
HiDi Formamide ABI 25ml P/N: 4311320, ABI.
Bảng 2. 4. Hệ thống mồi cho giải trình tự phân đoạn gen HA, NA
Phân đoạn
gen Mồi Trình tự
CúmA/H1pdm09
HA 1F AGT ATA CGA CTA GCA AAA GCA GGG G
1778R ATGACC GTG TCA GTA GAA ACA AGG GTG TTT NA Ba-NA-1F TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAGT
Ba-NA-1413R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT
Cúm A/H3
HA H3F1 ATG AAG ACT ATC ATT GCT H3R1184 ATG GCT GCT TGA GTG CTT
NA NAF1 AGC AAA AGC AGG AGT GAA RAT GAA TCC N2R-1455 GTA AAA TTG CGA AAG CTT ATA TAG
Cúm B
HA
2.2.4. Các chủng vi rút mẫu chứng
Mẫu chứng âm, chứng dƣơng sử dụng cho phản ứng Realtime RT-PCR đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng (VSDTTƢ); Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm – Nhật Bản (NIID); CDC-Mỹ.
Bảng 2. 5. Hệ thống mẫu chứng sử dụng trong nghiên cứu
STT Mẫu chứng Chủng/mẫu sử dụng Nguồn gốc
1 Chứng dƣơng A/H1pdm09 A/Vietnam/36955/2013-
H1N1pdm Viện VSDTTƢ
2 Chứng dƣơng A/H3 A/Vietnam/36999/2013-
H3N2 Viện VSDTTƢ
3 Chứng dƣơng A/H5 A/Vietnam/1194/2004-
H5N1 Viện VSDTTƢ
4 Chứng dƣơng A/H7 A/Anhui1/1/2013 – H7N9 NIID-Nhật Bản
5 Chứng dƣơng cúm B B/Vietnam/IS02397/2013 Viện VSDTTƢ
6 Chứng dƣơng hMPV; RSV;
PIV1,2,3; Rhino, Adeno CDC-Hoa Kỳ
7 Chứng âm phản ứng
(No Template Control-NTC)
Khuôn mẫu là nƣớc cất
tinh khiết Viện VSDTTƢ
8
Chứng âm tách chiết (Negative Extraction
Control-NEC)
Khuôn mẫu là môi trƣờng
Bảng 2. 6. Chủng chuẩn vi rút cúm trong nghiên cứu di truyền và đặc tính kháng nguyên Bắc Bán cầu 2012-2013 2013-2014 2014-2015 2015-2016
A/California/7/2009 (H1N1)pdm09-like virus A/Victoria/361/20 11 (H3N2)-like virus A/Victoria/361/20 11 (H3N2)-like virus A/Texas/50/ 2012 (H3N2)-like virus A/Switzerland/ 9715293/2013 (H3N2)-like virus B/Wisconsin/1/ 2010-like virus B/Massachusetts/ 2/2012-like virus B/Massachusetts/ 2/2012-like virus B/Phuket/3073/ 2013-like virus Nam Bán cầu 2013 2014 2015 2016
A/California/7/2009 (H1N1)pdm09-like virus A/Victoria/361/20 11 (H3N2)-like virus A/Texas/50/ 2012 (H3N2)-like virus A/Switzedland/ 9715293/2013)- like virus A/Hong Kong/4801/2014 (H3N2) )-like virus B/Wisconsin/1/ 2010-like virus B/Massachusetts/ 2/2012-like virus B/Phuket/3073/ 2013-like virus B/Brisbane/60/ 2008-like virus 2.2.5. Trang thiết bị và dụng cụ Trang thiết bị Hãng Phịng thí nghiệm an tồn sinh học cấp độ 3
Buồng cấy an toàn sinh học (Biosafety Cabinet)-Class Tủ ấm CO2
Kính hiển vi quang học đảo ngƣợc Tủ lạnh: 4ºC, -20ºC và -80ºC Máy ly tâm
Máy khuếch đại gen Máy Realtime PCR Máy giải trình tự gen Máy đọc ELISA Vortex Cân điện tử Viện VSDTTƢ Bioquell - Anh Sanyo Olympus Sanyo- Nhật Effendorf - Mỹ MJ-Mỹ Biorad ABI 3130-Avant Biorad IKA – Malaysia Sartorius
Các dụng cụ cần thiết trong nghiên cứu
* Dụng cụ lấy bệnh phẩm:
Que ngoáy họng và tỵ hầu.
Ống chứa môi trƣờng vận chuyển vi rút.
*`Trang bị phòng hộ cá nhân: quần áo chống dịch mặc một lần, khẩu trang N95…
* Dụng cụ thí nghiệm
Chai nhựa ni cấy tế bào 25cm2, 75cm2
Phiến nhựa vi lƣợng 96 giếng đáy chữ U hoặc V dùng cho phản ứng HI. Pipet tự động vi lƣợng các loại: 0,5 l – 1000 l
Đầu cơn vơ trùng các loại, có phin lọc: 0,5 l – 1000 l.
Ống eppendort: 0,2ml – 1,5ml, và các dụng cụ cần thiết khác… 2.3. SƠ ĐỒ TÓM TẮT NGHIÊN CỨU
2.3.1. Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 1
Mục tiêu 1: Xác định các tác nhân vi rút gây VĐHHC bằng phƣơng pháp
Realtime RT-PCR.
756 bệnh phẩm dịch họng, dịch nội khí quản thu thập ở bệnh nhân điều trị tại các bệnh thuộc khu vực miền Bắc Việt Nam
Phƣơng pháp Realtime RT- PCR (Trung tâm Cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng)
Xác định 12 căn nguyên vi rút VĐHHC
A/H1pdm09, A/H3, A/H5, A/H7, B (V/Y), hMPV, RSV, PIV1, PIV2, PIV3, Rhino, Adeno
2.3.2. Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 2
Mục tiêu 2: Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên của một số tác nhân vi rút chủ yếu gây VĐHHC trong giai đoạn nghiên cứu.
một số căn nguyên vi rút chủ yếu gây VĐHHC trong giai đoạn nghiên cứu Mẫu dƣơng tính bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR
Phân lập trên tế bào Vero,
A549, LLC/MK, Hep 2
(RSV, hMPV, Rhino, Adeno, PIV1,2,3)
Phân lập trên tế bào MDCK- SIAT1 (Cúm A/B) Xác định vi rút phân lập đƣợc bằng Realtime RT-PCR Định typ vi rút phản ứng bằng phƣơng pháp ức chế ngƣng kết hồng cầu (HAI) Khuếch đại chủng vi rút Giải trình tự mẫu đại diện chủng vi rút cúm theo thời gian
MEGA 6
-Xây dựng cây gia hệ HA, NA theo phƣơng pháp Neighbor Joining).
- Xác định sự khác nhau ở mức độ nucleotite hay axit amin giữa chủng vắc xin và chủng vi rút
DNA star v
Phân tích trình tự phân đoạn gen HA và NA thu đƣợc
Phƣơng pháp Sanger Sequencing Xuất hiện sự hủy hoại tế bào (CPE)
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR
Phƣơng pháp Realtime RT-PCR áp dụng trong luận án đƣợc thực hiện theo quy trình của Trung tâm Kiểm sốt và phịng ngừa bệnh tật (CDC- Hoa Kỳ), áp dụng trên hệ thống giám sát các vi rút hô hấp tại Việt Nam đƣợc thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, Viện Pasteur Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên và Viện Pasteur Nha Trang [22, 23, 34, 66, 99, 134, 137].
Phƣơng pháp Realtime RT-PCR thực hiện theo từng tác nhân riêng biệt (single realtime RT-PCR). Để xác định 12 tác nhân, nghiên cứu thực hiện 12 phản ứng riêng biệt, trong đó tác nhân cúm (A/H1pdm09, A/H3, A/H5, A/H7 và B – Victoria/Yamagata) chạy cùng một chu kỳ, 7 tác nhân vi rút hô hấp còn lại (hMPV, RSV, PIV1, PIV2, PIV3, Rhino và Adeno) chạy cùng một chu kỳ.
2.4.1.1. Tách chiết ARN
Nguyên lý
ARN tổng số đƣợc tách từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm vi rút. Sau đó, ARN đƣợc cho vào hỗn hợp RT-PCR với mồi đặc hiệu với từng loại vi rút VĐHHC. ARN có thể đƣợc tách chiết từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng hoặc từ dịch nổi nuôi cấy tế bào. Mẫu bệnh phẩm lâm sàng bao gồm: dịch tỵ hầu, dịch họng, dịch mũi…
Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng QIAGEN (CHLB Đức) để tách chiết ARN của vi rút. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc đánh giá là phƣơng pháp lý tƣởng nhất để tách chiết ARN từ vi rút.
Các bƣớc tiến hành: Theo quy trình thƣờng qui của bộ sinh phẩm
1. Trộn đều 140 l mẫu thử (dịch mũi họng, dịch súc họng, dịch nổi nuôi tế bào…) với 560 l đệm AVL. Để 10 phút.
2. Thêm 560l ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, trộn đều.
3. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm 2ml sạch. Tách 630 l hỗn dịch vào cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm. Lặp lại (3).
4. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
5. Tiếp tục rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/phút/ 3 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
6. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch. Cho 60 l nƣớc cất tinh khiết, ủ 2 phút, ly tâm 8000 vòng/phút/ 1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin. Phần dung dịch thu đƣợc trong ống ly tâm chính là ARN của vi rút.
7. Bảo quản tại -20ºC hoặc -80ºC.
2.4.1.2. Phản ứng Realtime RT-PCR
Sử dụng sinh phẩm SuperScripTM III RT/Platium Taq Mix với các cặp mồi và probe. Sản phẩm PCR khuếch đại sẽ xuất hiện/khơng xuất hiện tín hiệu huỳnh quang.
*Hỗn hợp sinh phẩm Thành phần Thể tích (ul)/ 1 phản ứng Số lƣợng phản ứng (N) 2x PCR master mix 12,5 12,5xN
SuperScrip III RT/Platium Taq Mix 0,5 0,5xN
Mồi xuôi* 0,5 0,5xN Mồi ngƣợc* 0,5 0,5xN Probe 0,5 0,5xN Nƣớc tinh sạch 5,5 5,5xN Tổng số 20 20xN * Sử dụng hệ thống mồi theo Bảng 2.2 và 2.3
* Cho ARN mẫu: ARN bệnh phẩm, chứng âm tách chiết, chứng âm: 5ul ARN. * Cài đặt chương trình trên máy
Tác nhân cúm (A/H1pdm09, A/H3, A/H5, A/H7 và B – Victoria/Yamagata)
Tăng nhiệt trƣớc phản ứng 60ºC /5 phút
RT Bƣớc 1 50ºC /30 phút
Ức chế hoạt hoá Taq Bƣớc 2 95ºC /02 phút
PCR 45 chu kỳ
Bƣớc 3 95ºC /15 giây Bƣớc 4 55ºC /30 giây
Bƣớc 5 Thu nhận tín hiệu huỳnh quang (FAM) Tác nhân vi rút hô hấp khác (hMPV, RSV, PIV1, PIV2, PIV3, Rhino và Adeno)
Tăng nhiệt trƣớc phản ứng 60ºC /5 phút
RT Bƣớc 1 50ºC /30 phút
Ức chế hoạt hoá Taq Bƣớc 2 95ºC /02 phút
PCR 45 chu kỳ
Bƣớc 3 95ºC /15 giây Bƣớc 4 55ºC /1 phút
Bƣớc 5 Thu nhận tín hiệu huỳnh quang (FAM)
*Phân tích kết quả: Tín hiệu huỳnh quang FAM thu nhận tại bƣớc sóng 520nm
Chứng âm phản ứng và chứng âm tách chiết: khơng có tín hiệu huỳnh quang.
Mẫu dƣơng tính: tín hiệu huỳnh quang đƣợc thu nhận trƣớc hoặc tại chu kỳ thứ 40 của phản ứng.
2.4.2. Phân lập vi rút Nguyên lý Nguyên lý
- Vi rút cúm và vi rút đƣờng hơ hấp khác có thể phân lập trên dịng tế bào LLC-MK2, HEp-2 và A549, MDCK/ MDCK-SIAT1.
- Quan sát sự có mặt của các vi rút hơ hấp trong tế bào dựa trên sự thay đổi hình dạng tế bào (sự huỷ hoại tế bào – CPE) hoặc phản ứng ngƣng kết hồng cầu (HA), phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu (HAI) [87, 127].
* Môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trƣờng nuôi tế bào sạch: D-MEM 10% FBS. Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy vi rút:
Vi rút cúm: D-MEM 2% BSA, 2,5ug/ml trypsin-acetyl hóa Vi rút RSV, hMPV, PIV và Rhino: D-MEM 2% FBS.
*Các bước tiến hành
1. Chọn phiến tế bào 24 giếng MDCK-SIAT1, HEp-2, A549 và LLC-