CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHỊNG THÍ NGHIỆM DÙNG TRONG CHẨN
1.3.3. Phản ứng Realtime PCR/RT-PCR
Phƣơng pháp Realtime PCR/RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang cho phép phát hiện
chính xác số bản sao ADN, ARN (định lƣợng) của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật [32, 39, 85].
- Mẫu dò là một đoạn oliognucleotit (vd: Taqman probe) đƣợc gắn với một chất nhuộm phát tín hiệu huỳnh quang ở đầu 5’ (R), đầu kia thì đƣợc gắn với thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang (Q). Khi mẫu dị cịn ngun vẹn, Q có vai trị nhận năng lƣợng phát ra từ R (hiệu ứng chuyển năng lƣợng huỳnh quang). Nếu có trình tự đích, mẫu dị và mồi sẽ gắn vào khn, q trình tổng hợp bắt đầu. Trong quá trình tổng hợp, enzym Taq DNA polymerase với hoạt tính exonuclease sẽ cắt các nucleotid của mẫu dị từ đầu 5’, giải phóng R khỏi Q, làm tăng tín hiệu huỳnh quang của R. Càng nhiều sản phẩm tạo thành thì càng nhiều mẫu dị bị phân cắt và tín hiệu của R phát ra càng nhiều. Mắt đọc tín hiệu huỳnh quang của máy sẽ thu tín hiệu R, xử lý bằng phần mềm và đƣa ra kết quả cuối cùng.
Hình 1. 16: Phân tích Real time RT-PCR
(Tín hiệu huỳnh quang FAM thu nhận tại bƣớc sóng 520nm)
Ƣu điểm của phƣơng pháp: nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết đƣợc lƣợng ADN đã tạo thành ở từng thời điểm; độ nhạy, độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm.
Nghiên cứu tại Braxin năm 2009, phƣơng pháp Realtime RT-PCR đa mồi đã đƣợc áp dụng để xác định các tác nhân hô hấp nhƣ cúm và RSV [32], Nghiên cứu tại Anh năm 2005 cũng áp dụng phƣơng pháp Realtime RT-PCR phát hiện RSV và hMPV, 4 phản ứng Realtime RT-PCR đa mồi có khả năng phát hiện 12 tác nhân vi rút hô hấp [49] hay quy trình phát hiện 14 tác nhân hơ hấp của CDC- Hoa Kỳ. Nghiên cứu so sánh trên 250 mẫu tỵ hầu thu thập năm 2010 tại Brazil cho thấy Realtime RT-PCR phát hiện 128/250 (51,2%) dƣơng tính với RSV so với 86/250 (34,3%) khi xác định bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (IFA),Tƣơng tự nhƣ vậy, tỷ lệ phát hiện vi rút cúm B bằng Realtime RT-PCR (3,6%) cao hơn so với IFA (1,2%), và phƣơng pháp Realtime RT-PCR có khả năng xác định đồng nhiễm vi rút cúm và RSV, hoặc RSV/A vàRSV/B trong khi IFA không xác định đƣợc. Tỷ lệ phát hiện tác nhân vi rút RSV bằng Realtime RT-PCR cũng cao hơn IFA trong nghiên cứu tại Hoa Kỳ năm 2010 [59]. Tại Ấn Độ, nghiên cứu của Malhotra B và cộng sự (2016) trên 155 mẫu bệnh phẩm nghi ngờ viêm đƣờng hô hấp cấp ở trẻ em dƣới 5 tuổi. Kết quả phân lập và áp dụng phƣơng pháp Realtime RT-PCR phát hiện đƣợc các căn nguyên vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp A/H1N1pdm09, Adeno, hMPV [73].