CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3. Định typ virút bằng phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng HI đƣợc tiến hành theo thƣờng quy của Viện VSDTƢ trong phịng thí nghiệm an tồn sinh học cấp 2.
Hình 2. 1. Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu
2.4.3.1. Chuẩn bị hồng cầu
Định typ vi rút cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 và B): sử dụng hồng cầu gà 0,5 % hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% trong đệm PBS, pH: 7,2.
2.4.3.2. Xử lý kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera)
Để loại bỏ những chất ức chế không đặc biệt trong kháng huyết thanh (HT) chuẩn:
- 1 thể tích kháng HT kết hợp với 3 thể tích dung dịch RDE (enzym phá huỷ các thụ thể – Recepter Destroying Enzym). Ủ 37ºC qua đêm.
- Bất hoạt ở 56ºC trong vòng 30 phút.
- Bổ sung 6 thể tích nƣớc muối sinh lý NaCl 0,85%. Nhƣ vậy, kháng HT chuẩn đã đƣợc pha loãng 1/10.
2.4.3.3. Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA)
Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng đáy tròn (hồng cầu gà) hoặc phiến nhựa 96 giếng đáy hình chữ V (hồng cầu chuột lang).
Nhận định kết quả: hiệu giá kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên gây ngƣng kết hồng cầu hồn tồn. Đó chính là một đơn vị ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên, 50 l kháng nguyên 8 đơn vị hay 25l kháng nguyên 4 đơn vị.
* Chuẩn độ lại kháng nguyên 8 đơn vị/ 50 l hay 4 đơn vị / 25 l.
2.4.3.4. Qui trình tiến hành phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI)
Hình 2. 2. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI
* Nhận định kết quả:
- Phản ứng đọc đƣợc khi:
+ Kháng huyết thanh chuẩn: ức chế ngƣng kết hoàn toàn + Chứng hồng cầu: ức chế ngƣng kết hoàn toàn.
- Hiệu giá ức chế ngƣng kết hồng cầu của chủng vi rút là giá trị tại độ pha loãng cao nhất của chủng vi rút gây hiện tƣợng ức chế ngƣng kết hồng cầu. - Phân typ của vi rút đƣợc xác đinh tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu giá ức chế ngƣng kết hồng cầu cao nhất.