CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự gen
Phân đoạn gen HA, NA đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger sequencing để theo dõi sự tiến hoá của vi rút cúm, sự xuất hiện các đột biến axit amin làm thay đổi đặc tính kháng nguyên, giám sát sự kháng hoặc giảm độ nhạy với Oseltamivir…[99, 134, 137]. Phân đoạn gen HA, NA đƣợc giải trình tự từ các chủng vi rút cúm phân lập đƣợc trên tế bào MDCK-SIAT1 với hiệu giá HA 4 đơn vị. Với vi rút cúm A/H1N1pdm09 (1178 nucleotide HA và 1413 nucleotide NA), vi rút cúm A/H3N2 (1184 nucleotide HA và 1455 nucleotide NA) và vi rút cúm B (1115 nucleotide HA).
2.4.4.1. Tách chiết vật liệu di truyền từ vi rút phân lập được
Sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral ARN Mini Kit, 250 preps, Cat No 52904, Qiagen. Tiến hành theo thƣờng quy bộ sinh phẩm.
2.4.4.2. Tổng hợp sợi ADN bổ trợ (cDNA)
Sử dụng mồi Uni 12 đặc hiệu cho vi rút cúm
Hỗn hợp 1 Hỗn hợp 2 Thành phần Thể tích (l) Thành phần Thể tích (l) Mồi Uni12 dNTP ARN 5 1 10 Bufferx5 DTT RNase inhibitor Expand RT 4 2 1 1 Tổng 16 Tổng 8
Ủ 65ºC/ 5 phút. Giữ lạnh ngay Giữ lạnh
2.4.4.3. Phương pháp PCR
Sử dụng bộ sinh phẩm PCR Qiagen proof start kit (Cat no 202203)
Thành phần Thể tích (l)
Đệm 10x Đệm Q
dNTPs (10nM)
1
Mồi xuôi (100pmol)
1
Mồi ngƣợc (100pmol) Enzym proof start Nƣớc cất tinh khiết cDNA 5 10 2 0,5 0,5 2 25 5 Tổng 50 1
Mồi: Sử dụng hệ thống mồi để giải trình tự gen HA, NA
* Chu kỳ nhiệt
Gen Chu kỳ nhiệt
HA 95ºC 5:00 94ºC 1:00 50ºC 1:00 72ºC 2:00 72ºC 7:00 4ºC ∞ 30chu kỳ NA 95ºC 5:00 94ºC 1:00 52ºC 1:00 72ºC 3:00 72ºC 7:00 4ºC ∞ 40chu kỳ
* Điện di sản phẩm PCR: trên thạch 1%, sử dụng thang trọng lƣợng phân tử
1kb.
2.4.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Mục đích: Loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa, sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự.
* Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả đặc hiệu: sử dụng bộ
sinh phẩm Purification kit Qiaquick 250 (Cat. No. 28106). ADN tinh sạch giữ ở -20ºC đến -80ºC.
* Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho nhiều băng, trong đó có băng sản phẩm cần giải trình tự gen: sử dụng bộ sinh phẩm Gel Extraction kit QIAEX II (Cat. No. 20051).
2.4.4.5. Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle Sequencing)
Sử dụng sinh phẩm của ABI (Applied Biosystems): BigDye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing kit P/N: 4336917
* Định lượng ADN
* Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng
Thành phần Thể tích (l)
Terminator Ready Reaction Mix Mẫu
Mồi (3,2pmol) xuôi hoặc ngƣợc Nƣớc cất tinh sạch
8
Tuỳ theo lƣợng ADN 1
X
Tổng 20
* Chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Chu kỳ
96ºC 1:00 1
96ºC 0:10
25
50ºC 0:05
60ºC 4:00
2.4.4.6. Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide
Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm dƣ thừa, tránh nhiễu trong quá trình giải trình tự.
Sử dụng bộ sinh phẩm DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat. No.63206) Các bƣớc tiến hành:
- Lắc nhẹ nhàng cột DyeEx 2.0 Spin - Nới lỏng nắp cột
- Loại bỏ phần dƣới cột DyeEx 2.0 Spin, đặt cột vào tuýp thu 2ml - Ly tâm 8000 vòng/2-3 phút loại bỏ dung dịch bảo quản gel - Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang tuýp 1,5ml sạch
- Dùng pipet cho toàn bộ sản phẩm vào cột gel - Ly tâm 8000 vòng/2-3 phút
- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin
- Làm khô và chuẩn bị đƣa vào máy giải trình tự gen. Trong trƣờng hợp khơng đƣa vào máy ngay, có thể giữ mẫu đã làm khơ ở -20°C không quá 24h
2.4.4.7. Điện di qua mao quản và đọc trình tự chuỗi nucleotide bằng đầu đọc laser
* Chuẩn bị mẫu điện di
- Cho 10µl HiDi Formamide (HiDi Formamide ABI 25ml P/N: 4311320) vào tube 1.5ml chứa ADN sau khi tinh sạch.
- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang đĩa 96 giếng (dành riêng cho ABI PRISM 3130-Avant)
- Ủ tại 96ºC/5 phút, sau đó chuyển ngay vào giá giữ lạnh. - Chuyển đĩa 96 giếng vào máy ABI PRISM 3100-Avant
- Sử dụng phần mềm DNA star v.8.0 để sắp xếp và thu thập phân đoạn gen HA và CLUSTAL W để dịch mã, so sánh sự khác biệt axit amin của protein HA, NA.
- Sử dụng phần mềm MEGA 6.
+ Xây dựng cây gia hệ của gen HA, NA: sử dụng phƣơng pháp Neighbor Joining. Trình tự axit amin của các chủng vắc xin đƣợc sử dụng làm gốc của cây gia hệ đƣợc lấy từ GenBank.
+ Xác định đƣợc tần suất tiến hóa của vi rút tại miền Bắc Việt Nam: đƣợc chia thành các nhóm khác nhau với giá trị tƣơng đồng gia hệ (bootstrap) >70%.