- Thu mẫu: Mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm 20 cm, mỗ
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. Xác định vi trí phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN
phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN
riboxom
Như đã trình bày ở phần trên hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống là dựa vào các nghiên cứu về hình thái học, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái. Mặc dù có nhiều phương pháp truyền thống được sử dụng trong nghiên cứu phân loại nhưng không có phương pháp nào tỏ ra vạn năng và thích hợp cho mọi đối tượng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Để khắc phục những hạn chế này chỉ có thể được giải quyết khi sử dụng phương pháp phân loại phân tử, dựa vào việc phân tích trình tự gen phần tử 16S ARN roboxom.
* Tách ADN tổng số
Hai chủng vi khuẩn NA10 và HT24 không chỉ có hoạt tính đối kháng cao nhất trong điều kiện invitro và thí nghiệm nhà lưới, đồng thời còn tác dụng tích cực lên khả năng sinh trưởng và phát triển của lạc, vì vậy hai chủng vi khuẩn này tiếp tục được tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa phần tử 16S ARN roboxom. Vì vậy, 2 chủng này đã được đinh loại bằng cách tách dòng và đọc trình tự gen 16S ARN riboxom.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
NA5 HT24 HT24
Hình3. 5. Điện di đồ ADN tổng số của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu
Hai chủng vi khuẩn NA10 và HT24 đã được tách ADN tổng số và điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %. Kết quả biểu hiện trên hình 7, ARN đã được loại sạch bằng ARNaza, nồng độ ADN chủng vi khuẩn NA5 đạt khoảng 1250 ng/µl và chủng vi khuẩn HT24 đạt khoảng 1035 ng/µl, độ sạch theo tỷ số A260/A280 đạt 1,8. Kết quả này cho thấy ADN của 2 chủng đạt tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Kết quả PCR
0,1 µl ADN tổng số (~100 ng) đã được dùng làm khuôn để phân lập gen 16S ARN riboxom. Sản phẩm PCR đã được điện di trên gel agarose 1% (hình 6).
Hình3. 6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn nghiên cứu
M: Marker 100 bp
Theo hình 8 cả 2 chủng vi khuẩn đều có 1 băng đặc hiệu có kích thước > 1,5 kb đúng với kích thước lý thuyết. Các sản phẩm này đã được dùng để tách dòng.
* Tách dòng đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom
Vecto tách dòng trong bộ kit TA cloning kit của hãng Invitrogen được thiết kế có đầu gắn Timin, phản ứng PCR được xúc tác bằng enzym Taq gold ADN polymeraza có 75% sản phẩm có đầu gắn Adenin. Vì vậy, sản phẩm PCR mới đã được dùng để gắn vào vectơ tách dòng PCR. Các bước thực hiện được tiến hành theo phương pháp đã nêu và được xúc tác bởi T4 ligaza.
1,2 kb 1,5 kb 2,0 kb