- Thu mẫu: Mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm 20 cm, mỗ
2.2.5.4 Phƣơng pháp tách dòng và xác định trình tự gen a.Phƣơng pháp tách dòng:
a.Phƣơng pháp tách dòng:
Thực hiện phản ứng lai:
Sản phẩm PCR đã gắn đầu Adenine được nối vào vectơ pCR TOPO 2.1 đã mở vòng và có dính sẵn đầu Thyamine. Thành phần phản ứng lai gồm vector pCR TOPO 2.1, sản phẩm PCR, H2O khử ion vô trùng, đệm 10x và dung dịch muối.
Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Nguyên tắc biến nạp:
Màng tế bào vi khuẩn dưới tác dụng của CaCl2 trở nên xốp và tạo lỗ cho các phân tử ADN ngoại lai có thể chui vào (gọi là tế bào khả biến). Sau đó tế bào được làm phục hồi trong môi trường có bổ sung một số nguyên tố vi lượng. Các thể biến nạp được phát hiện trong môi trường có kháng sinh, X-gal, IPTG .
Sản phẩm của phản ứng lai sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt
Tế bào khả biến chọn lọc sơ bộ dựa trên kiểu hình kháng Kanamycin và màu sắc xanh trắng của khuẩn lạc và được kiểm tra lại bằng kỹ thuật colony PCR với cặp mồi SP6 và T7
Các bƣớc tiến hành:
- Lấy 4µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gen chuyển vào tế bào DH5α- T1 (tế bào khả biến). Để trên đá trong 45 phút. Chú ý trộn và khuấy thật nhẹ nhàng tránh làm vỡ tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đặt trên đá 2 phút.
- Thêm vào mỗi ống 100µl SOC, đặt vào tủ lắc 200-220v/p ở 37oC trong 1giờ.
- Trải đĩa Agar- plate. Cấy trải 10µl dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycin 40µg/ml, X-gal.
- Đặt trong tủ ủ 37oC qua đêm (20-22 giờ).
- Chọn khuẩn lạc trắng (tốt nhất là khuẩn lạc màu trắng ngà), làm giàu trong 5ml môi trường LB có chứa Kanamycin và X-gal, nuôi cấy 37oC qua đêm.
Tách Plasmid ADN
Nguyên tắc:
Các khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp được làm giàu trên môi trường LB lỏng với Kanamycin để tăng sinh khối, thu vi khuẩn ở pha sinh trưởng, tách ADN plasmid bằng Kit.
Các bƣớc tiến hành:
- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút từ 1-5 ml sinh khối vi khuẩn E.coli , bỏ dịch nổi thu sinh khối.
- Thêm 250 µl dung dịch RS Buffer vào sinh khối vi khuẩn, dùng pipet trộn đều.
- Thêm 250 µl dung dịch BL Buffer, lắc trực tiếp cẩn bằng tay từ 3-4 lần. - Thêm 350 µl dung dịch NE Buffer, tiếp tục lắc bằng tay 3-4 lần. - Ly tâm 13.000vòng/phút ở 4o
C trong 10 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch pha trên vào cột và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong 1 phút.
- Nhấc màng ADN sang cột 2ml khác. Thêm 700 µl dung dịch WP Buffer vào và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Làm khô cột bằng cách ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển màng ADN sang một ống 1,5ml mới.
- Thêm 50-100 µl dung dịch EL Buffer vào cột, đợi trong 1 phút để hòa ADN tan hết.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN Plasmid.
Kiểm tra ADN plasmid bằng phƣơng pháp colony PCR
Sau khi thu được các thể biến nạp, tiến hành đánh dấu các thể biến nạp màu trắng và chọn làm nguyên liệu cho phản ứng PCR với cặp mồi SP6 và T7. Dụa vào kích thước sản phẩm PCR thu được có thể kết luận thể biến nạp có mang đoạn ADN mong nuốn hay không.
Phƣơng pháp tiến hành:
Dùng đầu tăm vô trùng lấy một phần nhỏ sinh khối khuẩn lạc cần kiểm tra, sau đó hòa vào trong hỗn hợp phản ứng colony PCR có thành phần sau:
Thành phần hỗn hợp phản ứng colony PCR (cho 1 phản ứng) SapphireAmp® Fast PCR Master Mix 8µl
Mồi Sp6 1 µl
Mồi T7 1 µl
Nước cất vô trùng 10 µl
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chu trình nhiệt cho phản ứng: 94 0C : 3 phút 94 0C : 45giây 500C : 30 giây 720C : 1,5phút 720C : 10 phút 4 oC : ∞
Sản phẩm PCR được điện di để kiểm tra lại trên gel agarose 1,5%, đệm TAE 1X.