Phƣơng pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ Nguyên tắc đo quang phổ kế:

- Thu mẫu: Mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm  20 cm, mỗ

2.2.5.2. Phƣơng pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ Nguyên tắc đo quang phổ kế:

Nguyên tắc đo quang phổ kế:

Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở 260nm của các bazơ nitơ purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260) cho phép xác định nồng độ axid nucleic dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD ở 260nm tương ứng với:

50mg/ml đối với ADN sợi đôi

40mg/ml đối với ARN và ADN sợi đơn. Do vậy nồng độ ADN được tính theo công thức sau:

CADN = OD 260.50.d

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

CADN: nồng độ ADN (µg/ml) d: độ pha loãng

Để kiểm tra độ sạch của mẫu, cần tiến hành đo OD ở 280nm. Đây là bước sóng mà ở đó các protein hấp thụ cao nhất. Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở 260nm, do đó làm sai lệch giá trị đo. Theo các nhà khoa học thì một dung dịch acid nucleic có tỉ số OD260/OD280 ở trong khoảng 1,8- 2 được xem là sạch (không tạp nhiễm).

Phƣơng pháp điện di ADN trên gel agarose:

Nguyên tắc: tại pH trung tính, ADN tích điện âm do có nhóm Phosphate nên dưới tác động của dòng điện 1 chiều, phân tử ADN sẽ di chuyển về điện cực dương.

Trình tự tiến hành: chuẩn bị bản gel agarose, lấy 4-10l sản phẩm trộn với 1l dung dịch tải đệm điện di (Loading Dye) tra mẫu vào các giếng gel, 4l thang chuẩn ADN 1 kb chạy so sánh. Tiến hành điện di trong đệm TAE 1X với hiệu điện thế 100V trong 30 phút rồi nhuộm gel bằng dung dịch Ethidium Bromide trong 5 phút. Kết quả được quan sát và chụp ảnh trên máy Gel-DOC.