- Thu mẫu: Mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm 20 cm, mỗ
2.2.5.3 Phƣơng pháp làm sạch sản phẩm PCR
Để xác định trình tự gen bằng cách đọc trực tiếp từ sản phẩm PCR, cần tiến hành làm sạch sản phẩm. Các bước làm sạch bao gồm (theo quy trình chỉ dẫn của bộ kit Bioneer:
- Điện di các mẫu cần làm sạch
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
eppendorf. Thêm dung dịch GB buffer vởi tỉ lệ 5 VGB: 1 Vgel (100 mg gel ≈ 100 µl)
- Ủ ở 600C trong 10 phút (hoặc cho đến khi gel tan hết)
- Sau khi tan hết, dung dịch sẽ có màu vàng. Nếu dung dịch có màu cam hoặc tím, cần bổ sung thêm 10 µl dung dịch CH3COONa 3M và trộn đều, dung dịch sẽ chuyển thành màu vàng.
- Thêm 1 lần thể tích isopropanol vào mẫu và trộn đều - Đặt cột có màng lọc vào ống 2 ml
- Hút toàn bộ dịch ADN cho vào cột (chú ý lượng lớn nhất cho vào cột không quá 750 µl, nếu dịch lớn hơn thì phải làm thêm 1 lần nữa), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Bỏ dịch li tâm bên dưới, chèn cột lại.
- Thêm 500 µl GB vào cột, ly tâm lại như trên.
- Bỏ dịch, rửa cột 2 lần bằng dung dịch WB buffer (đã được pha loãng bằng cồn tuyệt đối 5 lần) mỗi lần 500 µl. Để trong 5 phút và li tâm lại như trên. - Nhấc cột ra và đặt vào ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Thêm 30-50 µl dung dịch đệm EL. Để ở nhiệt độ phòng 5-10 phút, li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút, chuyển dịch li tâm sang ống eppendorf 1,5 mới khác, giữ ở -20 0
C.
Sau khi làm sạch, sản phẩm PCR được điện di để kiểm tra lại trên gel agarose 1,5%, đệm TAE 1X.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn