ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu và phân lập vi khuẩn
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ hậu môn của dê mắc bệnh tiêu chảy, giữ tăm bông trong thùng bảo ôn và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
Dê bình thường, dê sắp chết do bị tiêu chảy hoặc vừa mới chết được mổ khám để kiểm tra bệnh tích, lấy mẫu và cấy trực tiếp vào các môi trường đã chuẩn bị sẵn.
- Mẫu bệnh phẩm: dê bị chết do tiêu chảy được mổ khám lấy phủ tạng (tim, gan, lách, ruột non, ruột già, hạch ruột, các chất chứa trong ruột, phân trong trực tràng... Trong trường hợp không phân lập ngay, các mẫu được giữ ở 40C và trong thời gian không quá 4 giờ, ria cấy trực tiếp trên môi trường để nuôi cấy và phân lập.
Các dụng cụ lấy mẫu được chuẩn bị trước, đảm bảo vô trùng. Trong quá trình lấy mẫu phải tuân theo quy trình và phương pháp lấy mẫu trong nghiên cứu vi sinh vật thú y. Các mẫu thu thập được đựng trong ống nghiệm có nút vặn, phủ kín nắp bằng paraphin để đảm bảo môi trường yếm khí, ghi rõ số liệu và phải được tiến hành nhanh nhằm hạn chế thời gian tiếp xúc ngắn nhất với không khí, sau đó được chuyển nhanh đến phòng thí nghiệm.
2.4.2.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 2.4.2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp thường quy của Viện thú y Quốc gia. Nuôi cấy phân lập được tiến hành trong điều kiện yếm khí.
Mẫu phân, phủ tạng của dê tiêu chảy được ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey, bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 18-24 giờ. Vi khuẩn trong hỗn dịch cấy láng, mọc thành những khuẩn lạc như sau: Khuẩn lạc E.coli có màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, đường kính khuẩn lạc 1,5-2 mm. Khuẩn lạc C.perfringens to, hình tròn hoặc bầu dục, nhám, màu trắng và gây dung huyết đôi rất điển hình. Kết hợp với quan sát khuẩn lạc, chúng tôi kiểm tra tính chất bắt màu và hình thái...
39
2.4.2.2.2. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn
Từ các mẫu bệnh phẩm của dê bị bệnh tiêu chảy, chúng tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình phân lập, giám định vi khuẩn C.perfringens
Mẫu
Nuôi trong tủ ấm 370C/24-48h
Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng, vùng môi trường bao xung quanh mờ đục, màu vàng
Tiêm chuột bạch Tiêm tĩnh mạch cho chuột bạch Đếm số trên thạch máu yếm khí Nước thịt TGC (10ml) giữ ở 750C/25 phút
Lọc qua màng lọc Pha loãng
Thạch CW, có bổ sung 4% lòng đỏ trứng
Kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu
Đặc tính nuôi cấy Đặc tính sinh hoá
- Phản ứng CAMP test - Litmus milk
- SIM (H2S di động)
- Indol
- Lên men đường (Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40
Xử lý thích hợp
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình phân lập, giám định vi khuẩn E.coli
Mẫu
Thạch máu Thạch Macconkey Nước thịt
Chọn khuẩn lạc điển hình
Thạch máu Thạch Macconkey
Nhuộm Gram, kiểm tra hình thái Giám định các đặc tính sinh hóa
Chủng E.coli thuần khiết. Giữ giống trong môi trường BHI/Glycerin (-200C)
Xác định các đặc tính độc lực
Xác định serotype Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh
41
2.4.2.3. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
* Cách lấy mẫu
- Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí được nuôi cấy theo quy trình thường quy tại bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia.
- Vi khuẩn C. perfringens thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí. Vì vậy, không thể dễ dàng mọc trong những điều kiện mọc thông thường như một số vi khuẩn hiếu khí khác.
Chúng tôi tiến hành cấy mẫu ở nồng độ pha loãng cần thiết 106
. Dùng pipet vô trùng hút 0,2ml dịch pha loãng ở nồng độ trên, cấy vào đĩa thạch máu Columbia - Blood - Agar - Base. Mỗi mẫu phân cấy vào ít nhất 2 - 3 đĩa môi trường. Dùng que gạt thủy tinh dàn đều dịch nghiên cứu khắp bề mặt môi trường, sau đó xếp các đĩa thạch vào trong bình hút chân không, miệng và nắp được phủ một lớp paraffin tránh cho không khí vào. Dùng máy hút chân không hút hết không khí và khóa chặt vòi hút lại, đặt bình vào tủ ấm 370
C, sau 24 giờ lấy ra đếm số khuẩn lạc.
* Cách tính kết quả:
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp Kock, mẫu đựơc pha loãng ở nồng độ b, cấy 0,2ml mẫu cần nghiên cứu vào thạch đặc rồi đếm số khuẩn lạc (CFU) trên máy đếm. Số lượng vi sinh vật X trong 1gr phân được tính theo công thức: X = 5.a.b
Trong đó: a: là số lượng CFU trung bình trên 1 đĩa petri b: độ pha loãng mẫu, hệ số 5 vì cấy 0,2 ml.