2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) bao gồm các bộ phận vỏ thân, lá và lõi được thu hái vào tháng 1/2015 và tháng 3/2016 tại đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk (12o45’59’’N-108o19’31’’E). Tên khoa học của cây được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và tại phịng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-561 và C-612.
Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, chỉ lấy phần thân lõi đỏ phơi khơ. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung mơi có độ phân cực tăng dần như: n-hexane, chloroform hoặc
dichloromethane, etyl acetat và nước. Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng.
2.1.2. Các phương pháp nghiên cứu thực vật loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Prain)
2.1.2.1. Nghiên cứu vi phẫu
Phương pháp nghiên cứu
a) Tiêu bản vi học thân và lá
- Làm tiêu bản bằng phương pháp cắt trực tiếp, tẩy và nhuộm kép.
- Hoá chất sử dụng: dung dịch javen thương phẩm; dung dịch acid acetic 5%; dung dịch xanh methylene, dung dịch đỏ carmin.
- Dụng cụ quang học: Kính hiển vi màn hình kết nối camera Nikon Eclips Ci
b) Bột dược liệu
- Làm tiêu bản bằng phương pháp giọ tép.
- Dụng cụ quang học: Kính hiển vi màn hình kết nối camera Nikon NikonEclipsCi
Nguyên liệu
01 mẫu lá Sưa được thu tại khu vực đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk (12o45’59’’N-108o19’31’’E), được ký hiệu mẫu C-561-L và C- 612.
01 mẫu lá Sưa được thu tại đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội (21o01’42’’N- 105o51’12’’E), ký hiệu mẫu C-564-L.
02 mẫu lá thu được kiểm tra hình thái và làm tiêu bản tại phòng thực vật, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam và phịng thí nghiệm Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn -Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật để phục vụ cho các phân tích
Hình 2.2. Mẫu lá Trắc được thu tại Buôn Ma Thuột (C-562-L)
Phương pháp
Tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá được tách chiết theo phương pháp CTAB của Doyle và cs (1987) có cải tiến để phù hợp với điều kiện Việt Nam. Kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA
bằng đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di trên gel agarose 1%. DNA tổng số được pha loãng dùng cho phản ứng PCR ở nồng độ 10 ng/µl.
Trình tự các cặp mồi rpoB, rpoC và rbcL được tổng hợp dựa theo các nghiên cứu của Kress vả cs 2007 [72], của Hasebe và cs (1994) [73] (bảng 2.1)
Bảng 2.1. Thông tin các cặp mồi sử dụng
Tối ưu và nhân bản gen bằng phản ứng PCR
Phản ứng nhân gen được thực hiện trong tổng thể tích là 50µl với các thành phần gồm có: 32 l H2O, 5 l đệm, 5 l dNTP, 3 l mồi xuôi F (30 pM), 3 l mồi ngược R (30 pM), 1 l DNA tổng số, 1 l enzyme Taq polymerase. Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy PCR system 9700 với các chu kỳ như sau: biến tính ở 95oC 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 95oC 30 giây; bắt cặp ở 50oC, 52oC, 56oC trong 1 phút, kéo dài mạch ở 72oC trong 1 phút, cuối cùng là 72oC trong 10 phút để kết thúc phản ứng và giữ mẫu ở 4oC.
Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm gel bằng ethidium bromide và chụp ảnh trên hệ thống máy ảnh có chiếu ánh sáng UV.
Giải trình tự và xử lý số liệu
Giải mã trình tự nucleotide được thực hiện bằng kit BigDye terminator v3.1 trên máy đọc trình tự ABI 3100 Avant genetic analyzer (Applied Biosystems). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Sephadex G50 (Sigma) trước khi tiến hành đọc trình
Tên vùng
gen
Mồi xi Mồi ngược Nhiệt độ bắt cặp mồi
Chiều dài
vùng gen Tham khảo
rpoC CTTCTGCGAAATCAG AGTGTTTG CTTCTCCTTCCTC TAAATGATAAG 50 600 [72] rbcL TCTAGCACACGAAAG TCGAAGT CTTCGGCACAAA ATACGAAACG ATCTCTCCA 56 600 [73]
rpoB GCC ACC ATC GAA
TAT CTG GT
ACA CGA TCT
tự. Phần mềm ClustalW (Thompsom và cs, 1994) [74], GenDoc (Nicholas và cs, 1997) [75] và MEGA5.2 (Tamura và cs, 2011) [76] được dùng để phân tích dẫn liệu, xác lập bảng khoảng cách di chuyền.
2.1.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Các phương pháp sắc ký được sử dụng để chiết tách và phân lập các hợp chất từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó cịn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch.
2.1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, và sử dụng các phương pháp phổ
2.1.4.1. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS)
Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany).
2.1.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C- và DEPT NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz đo với TMS là chất chuẩn nội. Sử dụng các dung mơi hịa tan được hồn tồn mẫu thử chủ yếu là DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3.
2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp của H. Xiong và cs (2009) [77].
Chủng vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027
Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538
Nấm sợi (mốc): Aspergillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC 48112 Nấm men: Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 16404
Chủng chuẩn (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và lưu giữ tại phịng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên).
Pha dịch vi sinh vật: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh vật pha hòa tan vào 10 mL nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex được huyền dịch vi sinh vật. Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với chuẩn 0,5 McFarland (đo ở =550 nm) được huyền dịch nồng độ 150 x106 CFU/mL.
Môi trường: Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc. Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho vi khuẩn.
Các chất đối chứng dương là: Streptomycin (4 μM), Penicillin (50 μM ) cho vi khuẩn Gr (+) và Nystatin cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Tp. HCM.
Chất đối chứng âm là các vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử
Thử nghiệm và đánh giá kết quả
Chuẩn bị mẫu thử: Hòa tan mẫu trong DMSO 100% bằng máy vortex với nồng độ 4mg/mL với mẫu cao chiết và 1mg/mL với mẫu tinh.
Pha mẫu với DMSO 5% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ). Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µL (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ). Để trong tủ ấm ở 37oC trong 24h đối với vi khuẩn và 30oC/48h đối với nấm.
Mẫu được xác định có hoạt tính khi khơng có sự phát triển của vi sinh vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng (-) (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU<5). Mẫu biểu hiện hoạt tính được test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định được nồng ức chế tối thiểu MIC (g/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế).
Mẫu được xác đinh có hoạt tính khi giá trị MIC 200 g/mL đối với mẫu cao chiết và ≤ 50g/mL đối với mẫu tinh sạch.
2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase
PHƯƠNG PHÁP
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp của N.V. Bon và cộng sự (2018) [78].
Phép thử dựa trên hoạt tính xúc tác của enzyme α-glucosidase chuyển hố cơ chất
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid thành α-D-glucose và p-nitrophenol có màu vàng hấp
thụ ở =405 nm. Khi chất thử có hoạt tính ức chế enzyme, cường độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng sẽ giảm và phần trăm (%) ức chế enzyme được xác định tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử khi so sánh với đối chứng (-).
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng, thể tích phản ứng là 250 µL/giếng. Các thành phần phản ứng bao gồm: 50µL cơ chất p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG), 100µL đệm phosphate (0,1
mol/L, pH 7), 50µL enzyme -glucosidase từ vi khuẩn, nấm men, và gạo ở các nồng độ lượt là 1,0; 0,25 và 0,1 U/mL và mẫu thử (50 µL) ở các nồng độ khác nhau.
Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phosphate và acarbose được sử dụng làm đối chứng (+). Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở nhiệt độ 37o C. Sau 30 phút (60 phút đối enzym từ chuột), phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3 0,1 M. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định ở bước sóng 405 nm trên máy đo quang Infinite F50 (Tecan, Thụy Sỹ). Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase từ chuột được thực hiện theo phương pháp của N.V.Bon và cộng sự (2017) [79].
Enzyme -glucosidase từ gạo, từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae), từ vi
khuẩn (B. stearothermophilus), từ chuột cùng với cơ chất p-nitrophenyl -D-
glucopyranoside (pNPG) và acarbose mua tại hãng Sigma Aldrich, St. Louis City, MO, USA.
Khả năng ức chế enzyme -glucosidase của mẫu thử được xác định qua công thức:
Tỷ lệ ức chế (%) = [(A – B) /A] x 100% A giá trị quang của mẫu đối chứng B giá trị quang của mẫu thật
IC50 (half maximal inhibitory concentration), nồng độ của chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme -glucosidase, được xác định sử dụng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA).
2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
2.3.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561)
Lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (3,7 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phịng (5 lần x 7 lít ), lọc và cơ cất trong chân không. Phần cặn methanol (120g, M) được hòa vào hỗn hợp methanol/nước (tỉ lệ 1/1) rồi chiết phân bố lần lượt bằng các dung mơi có độ phân cực tăng dần như: n- hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước cho các cặn chiết tương ứng lần lượt là cặn n-hexane (29,0 g, MH), dichloromethane (45,1 g, MD), ethyl acetate (11,1 g,
ME) và cặn nước (12,0 g, MW).
Bã sau khi chiết bằng methanol được đun nóng với nước (4 lần x 3,0 L), sau 12 giờ thu được cặn chiết nước (4,2 g, W) ( Sơ đồ 2.1).
Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561)
2.3.1.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane
Cặn dịch chiết dichloromethane (45,1 g, MD) được hoà tan bằng một lượng methanol vừa đủ. Dung dịch thu được đem trộn với một lượng silicagel vừa đủ, cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được đưa lên cột sắc ký, cột được nhồi bằng silicagel pha thường (Merck, loại 400 – 630 mesh). Cột sau khi đã tương đối ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên đầu cột, với hệ gradient
Chú thích: M: methanol W: nước H: n-hexane D: dichloromethane E: ethyl acetate Ngâm MeOH (5 x 7,0 L) n-hexane Chiết phân bố nước ethyl acetate dichloromethane Đun nước (4 x 3,0L) Lõi gỗ (3,7 kg)
Bã sau khi chiết
ME (11,1 g) MH (29,0 g) W (4,2 g) MW (12,0 g) MD (45,1 g) Cao methanol (120 g, M)
dung môi rửa giải là n-hexane/acetone (3/2-0/1) tăng dần độ phân cực thu được 6 phân đoạn từ (MD1-MD6).
Phân đoạn MD2 (7,2 g) được tiếp tục phân tách trên cột CC, silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải chloroform/acetone (99/1, v/v) thu được 7 phân đoạn được ký hiệu từ (MD2.1-MD2.7). Phân đoạn MD2.3 (1,5 g) được phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1, 8/1, v/v) được 4 phân đoạn ký hiệu từ (MD2.3A-MD2.3D). Chạy tách chất phân đoạn MD2.3A (0,4 g) trên cột sắc ký silicagel pha thường, làm sạch với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1, v/v) thu được 2 hợp chất sạch
DT.01 (30 mg) và DT.03 (20,5 mg). Phân đoạn MD2.6 (0,6 g) được chiết tách trên cột
sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường và rửa giải bởi hệ dung môi n-
hexane/acetone (5/1, v/v) được chất sạch DT.02 (25 mg) (Sơ đồ 2.2).
Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane
Chú thích:
O.PC.C: Sắc khí cột, pha thường. SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ CA: chloroform/acetone SiO2, O.P C.C CA (99/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (9/1, v/v) SiO2, O.P C.C HE (5/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (3/2-0/1) MD (45,1 g) MD3 2,1 g MD2 7,2 g MD5 0,8 g MD4 3,0 g MD6 1,5 g MD2.2 0,5 g MD2.4 1,1 g MD2.5 0,95 g MD2.6 0,6 g MD2.7 0,8 g MD2.3A 0,4 g DT.02 25 mg MD1 5,5 g MD2.1 0,2 g MD2.3B 0,25 g MD2.3C 0,15 g MD2.3D 0,2 g MD2.3 1,5 g SiO2, O.P C.C HA (9/1, v/v) DT.01 30 mg DT.03 20,5 mg
2.3.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate
Cặn ethyl acetate (11,1 g, ME) được tiến hành phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/acetone theo tỷ lệ (40/1, 30/1, v/v) thu được 11 phân đoạn ký hiệu từ (ME1-ME11). Phân đoạn ME1 (850 mg) tiếp tục được phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel pha thường và giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (5/1, v/v) tăng dần độ phần cực, thu được hợp chất DT.04 (5,0 mg).
Phân tách phân đoạn ME9 (650 mg) trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane-aceton (3/1, v/v) thu được 2 phân đoạn ME9.1 (420 mg) và ME9.2 (120 mg). Tách tiếp phân đoạn ME9.1 trên cột silicagel bằng hệ chloroform/methanol theo tỷ lệ (9/1, v/v) thu được hợp chất DT.05 (8 mg). (Sơ đồ 2.3).
Sơ đồ 2.3. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết ethyl acetate
Chú thích:
O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. SiO2: silicagel
Hệ HA: n-hexane/acetone
Hệ DA: dichloromethane/acetone Hệ HE: n-hexane/ethyl acetate Hệ MW: methanol/nước SiO2,O.P C.C CM (9/1, v/v) SiO2, O.P C. HE (5/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (3/1, v/v) SiO2, OP.CC DA (40/1, 30/1, v/v ME (11,1 g) ME2 370 mg ME7-8 1000 mg ME9 650 mg ME9.1 420 mg ME1 850 mg DT.04 5,0 mg DT.05 8 mg ME10-11 350.5 mg ME9.2 120 mg ME4-6 4992 mg ME3 900 mg
2.3.1.3. Phân lập các chất từ cặn chiết nước cao nước đun sôi
Cao nước đun sôi (4,2 g, W) được tách phân đoạn trên sắc ký cột HP-20 bằng chất hấp phụ silicagel pha đảo với hệ dung môi rửa giải nước/methanol (1/0-0/1), thu được 5 phân đoạn (W1-W5).
Phân đoạn W2 (210,0 mg) chạy tách chất trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường, triển khai theo chế độ gradient dung mơi dichloromethane/methanol/nước (30/1/0,1, v/v/v), sau đó tiến hành sắc ký bản mỏng TLC thu được 2 phân đoạn (W2.1- W2.2). Tinh chế phân đoạn W2.2 (150 mg) trên sắc ký cột CC với silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate/ acid formic (130/80/2, v/v/v) thu được chất sạch DT.06 (5,5 mg).
Phân đoạn W4 (800 mg) được phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol/nước (30/1/0,1, v/v/v), thu được 4 phân đoạn từ W4.1-W4.4. Tiến hành tách chất phân đoạn W4.1 (65 mg) trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/ethyl
Sơ đồ 2. 4. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cao nước đun sơi
W1.1 70 mg
Chú thích:
O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. HP-20: diaion HP-20
SiO2: silicagel
Hệ WM: nước/methanol
Hệ DMW: dichloromethane/methanol/nước Hệ HEF: n-hexane/ethyl acetate/ acid formic
SiO2, O.P C.C HEF (130/80/2, v/v/v) SiO2, O.P C.C HEF (80/80/2, v/v/v) SiO2, O.P C.C DMW (30/1/0,1, v/v/v) SiO2, O.P C.C DMW (3/1/0,1, v/v/v) SiO2, O.P C.C DMW (30/1/0,1, v/v/v) HP-20,WM (1/0-0/1) W (4,2 g) W2 210 mg W1 937,9 mg W4 800 mg W3 250 mg W5 300 mg W4.1 65 mg W4.2 106 mg W4.3 102 mg W4.4 150 mg W2.1 60 mg W2.2 150mg DT.07 (5,5 mg) W1.3 66,6 mg W1.4 120 mg W1.5-1.7 159 mg W1.8-1.9 292 mg W1.2 80 mg DT.06 (5,0 mg)
2.3.2. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612)
Lõi gỗ cây Sưa (1,2 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ sau đó ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần x 3 lít), lọc và cơ cất trong chân khơng thu được phần cặn methanol (60,3 g, M). Phần cặn methanol này được hoà tan trong lượng nước vừa