CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ VI PHẪU VÀ DNA CỦA CÂY SƯA (DALBERGIA
3.1.2. Kết quả nghiên cứu DNA cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)
3.1.2.1. Kết quả nhân bản vùng gen rpoC
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% cho thấy rõ một băng DNA kích thước khoảng 600 bp tương ứng với kích thước vùng gen rpoC dự kiến (hình 3.6)
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1%
1. Mẫu Trắc, 2.Mẫu Sưa đỏ
3.1.2.2. Đặc điểm phân tử vùng gen rpoC
Kết quả cho thấy: Chỉ số tương đồng của vùng gen rpoC từ hai mẫu nghiên cứu với trình tự tương đồng từ hai loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis) và Sưa (Dalbergia tonkinensis) tham khảo là 99%. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy vùng gen rpoC có khả năng dùng trong phân loại các loài của chi Sưa (Dalbergia).
Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis của Việt Nam đã được đăng kí tại Genbank với mã số lần lượt
là KY287755 và KY287750.
3.1.2.3. So sánh khả năng phân loại loài sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis) Việt Nam của một số vùng gen lục lạp
3 đoạn gen rpoB, rbcL và rpoC có chiều dài 600bp đã được nhân bản và đọc trình tự 2 chiều. Kết quả giải trình tự hai chiều nhận được của mỗi đoạn gen sau đó được ghép nối với nhau để thu về một trình tự duy nhất bằng phần mềm Chromas Pro. Trình tự thu được sau hiệu chỉnh ở định dạng file fasta (.fas) được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Công cụ BLAST cho phép chúng tôi định danh đến mức độ lồi của các trình tự thu được bằng cách xác định các trình tự tương đồng với trình tự này trong cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen (GenBank). Sử dụng phương pháp tìm kiếm những trình tự có điểm số bắt cặp cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong cơ sở dữ liệu, công cụ BLAST tìm những trình tự tương đồng thơng qua việc phát hiện các đoạn bắt cặp ngắn theo từng bộ 3 nulceotide gối lên nhau giữa trình tự cần truy vấn và trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Tiếp đó, nếu mỗi bộ 3 này đạt tới một ngưỡng T tối thiểu được tính tốn bằng ma trận điểm (scoring matrix), chúng sẽ được đưa vào sắp xếp thẳng hàng (alignment) bởi thuật toán được sử dụng trong công cụ BLAST. BLAST sẽ cho ra kết quả các trình tự tương đồng được thể hiện ở dạng bảng đi kèm với thơng tin của trình tự trên ngân hàng gen cùng với các chỉ số tương đồng (ident), độ dài của chuỗi trình tự được bắt cặp ở dạng phần trăm (query cover), điểm số bắt cặp giữa 2 trình tự. Trình tự nào có điểm số tương đồng cao hơn sẽ có mức độ giống nhau cao hơn. Dựa vào việc phân tích các chỉ số tương đồng của các trình tự sẽ giúp đưa ra được kết quả giám định loài cho các mẫu vật nghiên cứu.
Kết quả so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gen (NCBI) bằng cơng cụ Blast cho thấy 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC bắt cặp cao nhất với loài Dalbergia tonkinensis với điểm số bắt cặp tương đồng (query cover) tương ứng lần lượt là 99%,
98% và 97%. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại và giải mã đúng trình tự vùng gen đích.
Kết quả phân tích trình tự trên phần mềm Chromas Pro cho thấy đã giải mã tốt được đoạn gen có chiều dài 511bp cho vùng gen rpoC, đoạn gen dài 563pb cho gen rbcL và đoạn gen dài 565bp cho gen rpoB. Kết quả phân tích lần lượt 3 vùng gen này trên phần mềm ClustalW, so sánh với 4 loài Dalbergia khác (bảng 2) cho thấy đoạn gen rpoC dài 511bp của Sưa mã hoá được cho 170 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm
22,9%; Thymine chiếm 30,9%; Adenine chiếm 29,7%; Cytosine chiếm 16,4%. Thành phần A và thành phần T khơng có sự dao động lớn. Thành phần C và G có khoảng dao động lần lượt 16,4% đến 22,9% và 16,4% đến 23,5%. Phát hiện 8 vị trí biến đổi (variable) tương ứng ở các vị trí 54 (G->A); 62 (A->G); 64(A->T); 70(A->G); 74(A->C); 238(A- >G); 290(A->G); 369(C->T), trong đó giá trị mang thơng tin (Parsimory informative) chiếm 1 vị trí là 54 (G->A). Số cặp nucleotide tương đồng trung bình là 503. Hệ số trung
bình của cặp Si (Transition) và Sv (transversion) là 1.0. Hệ số này đối với vị trí codon thứ nhất, thứ hai và thứ ba tương ứng là 1.
Đoạn gen rpoB dài 565bp của Sưa đỏ mã hoá được cho 197 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm 23,6%; Thymine chiếm 26,7%; Adenine chiếm 31,2%; Cytosine chiếm 18,5%. Phát hiện 05 vị trí biến đổi (variable) tương ứng ở các vị trí 226 (G- >A); 264 (T->A); 414(G->T); 563(C->T); 608(G->A) ở cả hai lồi Sưa đỏ và Trắc), trong đó có 1 vị trí là 563(C->T) có ý nghĩa Parsimony
Vùng gen rbcL của 2 mẫu nghiên cứu sau khi loại bỏ các vùng nhiễu rối thì thu được đoạn gen dài 562bp. . Kết quả phân tích trên phần mềm Mega cho thấy đoạn gen này mã hoá được cho 183 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm 22,4%; Thymine chiếm 29,3%; Adenine chiếm 27%; Cytosine chiếm 21,3%. Khi so sánh vùng gen này với vùng gen rbcL tương ứng của 5 loài Dalbergia khác trên Genbank phát hiện thấy có 14 vị trí biến đổi, trong đó có 11 vị trí Nu có ý nghĩa Parsimony.
Kết quả so sánh khả năng phân biệt ở cấp độ loài của 3 vùng gen này với 6 loài Dalbergia khác (sử dụng loài giáng hương Pterocarpus santalinus (KJ749960.1) là lồi ngồi nhóm) được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền của từng vùng gen so sánh giữa 2 mẫu nghiên
cứu với 6 loài trên Genbank
rpoB rpoC rbcL C-561-L 0 0 0 C-564-L 0 0 0 D. tonkinensis (FR854140) 0 0 0 D. cochinchinensis (FR854124) 0.0032 0.008 0.01 D. assamica (FR854122) 0.0024 0.003 0.0067 D. sissoo (JX856444) 0.003 0 0.006 D. odorifera (GQ435947.1) 0 0 0.0032 Pterocarpus santalinus (KJ749960.1) 0.0064 0.007 0.015
Gen rpoB và rpoC là gen mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu các cây họ dầu (Dipterocarpaceae), đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh lồi. Hiện nay rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong
nhiều nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%) [83].
Trong nghiên cứu này của chúng tôi, kết quả kiểm tra khả năng phân loại một số loài sưa (bảng 3.1) của 3 vùng gen rpoB, rpoc và rbcL cho thấy đoạn gen rpoB dài 565bp nhưng chỉ chứa 5 vị trí Nu có khả năng biến đổi, trong đó có 1 Nu mang ý nghĩa parsimony, trong khi đoạn gen rpoC dài 511bp chứa 8 vị trí Nu có khả năng biến đổi, 1 vị trí Nu có ý nghĩa Parsimony, điều đó cho thấy gen rpoC có tiềm năng phân loại các loài sưa tốt hơn so với gen rpoB, tuy nhiên khi so sánh các hệ số khoảng cách di truyền giữa 2 vùng gen này thì cho thấy khả năng phân loại của 2 gen này khá giống nhau.
Cụ thể vùng gen rpoC không chỉ ra được sự khác biệt giữa 3 loài D. tonkinensis, D. sissoo và D. odorifera nhưng phân biệt khá rõ các lồi cịn lại. Trong
khi vùng gen rpoB không chỉ ra được sự khác biệt giữa là D. tonkinensis và D.
odorifera nhưng với các lồi cịn lại thì cho chỉ số về khoảng cách di truyền cũng khơng cao. Như vậy có thể kết luận đối với 2 vùng gen rpoB và rpoC thì có khả năng phân biệt được các lồi sưa, tuy nhiên khơng phải là chỉ thị thích hợp nhất để sử dụng. So sánh với 2 vùng gen rpoB và rpoC thì vùng gen rbcL đã thấy rõ khả năng phân biệt các loài sưa tốt hơn hẳn so với 2 vùng gen rpoB và rpoC. Kết quả so sánh vùng gen rbcL với 5 lồi sưa khác (GB) thì phát hiện14 vị trí biến đổi, trong đó có đến 11 vị trí Nu mang ý nghĩa Parsimony. Chỉ số khoảng cách di truyền khi so sánh với 5 loài sưa khác của vùng gen này đều cho chỉ số tương đối cao hơn nhiều so với 2 vùng gen rpoB và rpoC.
Khả năng phân biệt các loài Sưa của 3 vùng gen rpoB, rpoC và rbcL được thể hiện ở hình 3.6.
Kết luận: 3 vùng gen rpoB, rpoC và rbcL là thích hợp để phân loại các loài
thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt tương ứng lần lượt là 99%, 98% và 97%. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại và giải mã đúng trình tự vùng gen đích.
Trình tự 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC của loài sưa Việt Nam đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750.