Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 1
- Điều tra sự phân bố muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus theo từng sinh cảnh và theo thời gian.
- Xác định và đánh giá các chỉ số của muỗi và bọ gậy Ae. aegypti và
Ae. albopictus trung bình theo sinh cảnh và theo thời gian tại các điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định và Gia Lai.
- Quan sát, mơ tả một số tập tính muỗi trú đậu trong và ngoài nhà, đậu trên các giá thể khác nhau của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus.
- Tìm hiểu đặc điểm ổ bọ gậy của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus
theo từng sinh cảnh.
- Phân tích yếu tố mùa ảnh hưởng đến DCCN có bọ gậy Ae. aegypti
và Ae. albopictus theo từng sinh cảnh.
- Xác định tỷ lệ muỗi trưởng thành Ae. aegypti và Ae. albopictus thu
thập ngoài thực địa nhiễm với virus Dengue.
2.4.2. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 2
- Xác định mức độ nhạy cảm của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus tại các sinh cảnh nghiên cứu của tỉnh Gia Lai và Bình Định với các hóa chất diệt cơn trùng gồm alphacypermethrin 30mg/m2, lambdacyhalothrin 0,05%, deltamethrin 0,05%, permethrin 0,75% và malathion 5%.
- Xác định đột biến trên gen kháng ngã gục kdr ở các quần thể muỗi
Ae. aegypti đã kháng với hóa chất khi thử sinh học tại các sinh cảnh được
chọn thuộc tỉnh Bình Định và Gia Lai.
2.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.5.1. Kỹ thuật soi bắt muỗi ban ngày 2.5.1. Kỹ thuật soi bắt muỗi ban ngày
Mục đích: Xác định sự phân bố của muỗi truyền bệnh SXHD, một số tập tính và các chỉ số véc tơ cũng như thu thập mẫu muỗi để xác định tỷ lệ muỗi nhiễm virus Dengue tại các sinh cảnh được chọn.
Thời gian thực hiện từ 7 giờ đến 17 giờ [6].
Cách tiến hành: Mỗi nhóm điều tra gồm ít nhất ba người tiến hành soi nhà ngày. Người điều tra một tay cầm ống tube hoặc máy bắt muỗi một tay cầm đèn pin. Bắt đầu tìm muỗi từ cửa ra vào và đi dần vào trong, đến tất cả các phòng, vừa đi vừa rọi đèn vào tường, màn, rèm, quần áo, các vật treo trên tường, dưới gầm giường, bàn ghế.
Chú ý tìm những nơi ánh sáng yếu, nơi tập trung sinh hoạt gia đình như phịng ngủ, phịng khách, nhà tắm. Tiếp theo dùng tube cầm sẵn trên tay úp nhanh lên muỗi, di chuyển ngón tay trỏ xuống bịt ống tube lại không cho muỗi bay ra, sau đó dùng bơng nút ống lại.
Cùng lúc đó cũng tiến hành điều tra muỗi ngồi, tập trung những khu vực có bụi cây, các khu vực có DCCN.
Ghi vào nhãn: địa điểm, thời gian, giá thể đậu và nơi bắt muỗi.
2.5.2. Kỹ thuật điều tra bọ gậy Aedes
Được thực hiện vào ban ngày, song song với phương pháp soi bắt muỗi trong nhà ngày, với mục đích xác định nơi sinh sản của muỗi, các chỉ
Cách tiến hành: Sử dụng bộ dụng cụ điều tra côn trùng để thu thập bọ gậy Aedes trong tất cả DCCN ở hộ gia đình điều tra. Quan sát cả trong nhà và xung quanh nhà ở tất cả các DCCN để ghi nhận tất cả các DCCN có hoặc khơng có bọ gậy, chủng loại DCCN. Những DCCN có bọ gậy, bọ gậy sẽ được thu thập và vận chuyển về phịng ni của khoa Cơn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn để thực hiện nhân nuôi đến giai đoạn trưởng thành.
2.5.3. Kỹ thuật thu thập bọ gậy Aedes
(a) (b)
Hình 2.3.(a) Cách thu thập bọ gậy ở dụng cụ chứa nước nhỏ, (b) Cách thu thập bọ gậy ở dụng cụ chứa nước lớn [124].
Mục đích xác định nơi phát sinh nhiều muỗi nhất tại các điểm nghiên cứu. Đối với các DCCN lớn như bể nước, phuy thì dùng vợt có đường kính 22 cm để thu thập (vợt 5 vịng chuẩn và sau đó nhân với hệ quy đổi theo thể tích từng lồi) (hình 2.3b), cịn đối với những DCCN nhỏ như lọ hoa, máng nước gia cầm, chum vại và phế thải thì tiến hành đổ vào khay nhỏ hoặc trực tiếp dùng ống hút bắt bọ gậy [124].
Bọ gậy sau khi thu thập xong được vận chuyển về phịng ni muỗi của khoa Côn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn.
2.5.4. Kỹ thuật định loại muỗi và bọ gậy Ae. aegypti và Ae. albopictus
Sử dụng bảng định loại muỗi Aedes spp. của Vũ Đức Hương (1997) [27] và Leopoldo M. Rueda (2004) [84] để định loại hình thái ngồi của muỗi Aedes truyền bệnh SXHD.
Hình 2.4. Tấm lưng ngực của muỗi Ae. aegypti (a) và Ae. albopictus (b) [84]
Hình 2.5. Răng lược đốt bụng VIII của bọ gậy Ae. aegypti (a) và Ae. albopictus (b)
“Nguồn: Leoplodo, 2004”[84]
(a) (b)
2.5.5. Kỹ thuật xét nghiệm muỗi nhiễm virus Dengue
Mục đích: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tỷ lệ muỗi
Ae. aegypti và Ae. albopictus ở thực địa nhiễm virus Dengue [72],[81].
Cách tiến hành: Muỗi truyền bệnh SXHD thu thập ngồi thực địa trong q trình điều tra tại từng điểm nghiên cứu được mang về phịng thí nghiệm và được định loại lại. Sau đó cho muỗi vào tube eppendorf theo từng lồi, mỗi tube khơng quá 20 cá thể muỗi trong một mẫu xét nghiệm. Sau đó mẫu muỗi trong tube eppendorf được nghiền trong dung dịch đệm. Dung dịch muỗi nghiền này sẽ được dùng trong kỹ thuật One step RT-PCR để xác định virus trên mẫu muỗi (chi tiết Phụ lục 2).
Sơ đồ thí nghiệm xác định muỗi Aedes nhiễm virus Dengue
2.5.6. Kỹ thuật nhân nuôi muỗi Aedes
Mục đích: Nhân ni đủ số lượng muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus
trưởng thành để thử nhạy cảm với các hóa chất diệt cơn trùng. Mẫu muỗi cái Aedes thu thập ngoài thực địa
Tách chiếc RNA virus
Sử dụng bộ kít “Viral RNA MiniKit” hãng Qiagen
Đọc kết quả sản phẩm sau khi chạy điện di Xác định nhiễm virus Dengue thơng qua phương
Bọ gậy thu thập ngồi thực địa tại các điểm điều tra được chuyển ngay về phịng ni khoa Cơn trùng, sau đó cho bọ gậy vào các khay nuôi. Chú ý ghi rõ các thông tin về địa điểm, ngày tháng thu thập lên từng khay. Cho thức ăn vào từng khay nuôi bọ gậy và được nhân ni trong điều kiện phịng nuôi nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm 80-85% và chiếu sáng 10/24 giờ.
Hằng ngày kiểm tra và nhặt quăng từ khay nuôi bọ gậy cho vào cốc đặt trong các lồng nuôi riêng, khi quăng lột xác thành muỗi trưởng thành thì tiến hành định loại để xác định loài muỗi Aedes. Muỗi Aedes 2-3 ngày tuổi cho đốt chuột nhắt trắng, sau khi hút máu 2-3 ngày cho muỗi đẻ vào miếng giấy thấm đặt sẵn trong lồng nuôi. Nhân nuôi đến thế hệ F1 và những cá thể muỗi cái khỏe mạnh sẽ được sử dụng để thử nhạy cảm.
Hình 2.6. Phịng ni muỗi khoa Cơn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn
2.5.7. Quy trình thử nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất
Thực hiện theo quy trình “Hướng dẫn quy trình thử nhạy cảm của muỗi Aedes với hóa chất diệt muỗi” của Bộ Y tế năm 2010 [5].
Mục đích của thử nhạy cảm là phát hiện các cá thể muỗi trong quần thể muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus cịn nhạy cảm, có khả năng kháng
hay đã kháng với hóa chất để làm cơ sở cho việc lựa chọn và sử dụng hóa chất một cách thích hợp và hiệu quả.
Bảng 2.2. Các hóa chất diệt cơn trùng, nồng độ và thời gian thử nghiệm
Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ Thời gian tiếp xúc
Phospho hữu cơ Malathion 5% 1 giờ
Pyrethroid Permethrin Deltamethrin Lambdacyhalothrin Alphacypermethrin 0,75% 0,05% 0,05% 30mg/m2 1 giờ 1 giờ 1 giờ 1 giờ
Các loại giấy thử nhạy cảm: Giấy thử tẩm hóa chất diệt cơn trùng và giấy đối chứng do TCYTTG cung cấp được dùng thử nghiệm (bảng 2.2).
- Điều kiện thử nghiệm:
+ Phòng thử nghiệm phải đảm bảo khơng tồn dư hóa chất diệt cơn trùng.
+ Nhiệt độ phòng thử từ 25 ± 20C, độ ẩm 80-90%.
+ Dụng cụ thử nghiệm phải sạch, khô ráo. Sau mỗi lần thử nghiệm phải rửa sạch dụng cụ, phơi khô.
+ Chọn muỗi thử nghiệm: Muỗi cái Ae. aegypti và Ae. albopictus thu
được từ bọ gậy ở thực địa. Bọ gậy thu thập ở nhiều ổ nước khác nhau và ghi lại các loại ổ nước đã thu thập bọ gậy. Nếu khơng đủ số lượng muỗi thử thì có thể ni, cho muỗi đẻ và sử dụng thế hệ F1 để thử sinh học. Chọn muỗi từ 2-5
ngày tuổi, chưa hút máu, đã hút đường glucose 10%. Muỗi thử nghiệm phải khỏe mạnh, cơ thể nguyên vẹn.
+ Mỗi loại hóa chất cần 150 cá thể muỗi cái trưởng thành khỏe mạnh để thử nghiệm. Trong đó, có 100 muỗi cho tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất và 50 muỗi cho tiếp xúc với giấy đối chứng.
Hình 2.7. Bộ dụng cụ thử nhạy cảm của muỗi Aedes với hóa chất
Quy trình thử nghiệm
+ Bước 1: Chuẩn bị các ống nghỉ: Đặt tờ giấy trắng cuốn thành hình trụ cho vào ống nghỉ. Dùng vòng kim loại bạc giữ chặt tờ giấy sát vào thành ống, lắp đế vào ống.
+ Bước 2. Sử dụng tube hai đầu bắt muỗi trong các lồng muỗi, chọn những con muỗi cái khỏe mạnh, đạt tiêu chuẩn cho vào ống nghỉ, mỗi ống 20 con muỗi.
+ Bước 3. Chuẩn bị ống đối chứng và ống thử nghiệm: dùng tờ giấy đối chứng cuốn thành hình trụ lồng vào bên trong mỗi ống đối chứng và
dùng vòng kim loại giữ sát giấy vào thành ống. Khi lấy giấy trong hộp kín, phải dùng panh để hóa chất khơng dính vào tay và dính ra các tờ giấy khác.
+ Bước 4: Chuyển muỗi vào các ống đối chứng và ống thử nghiệm: Lắp các ống nghỉ vào các ống đối chứng và ống thử nghiệm. Chuyển tấm đẩy giữa đến chỗ lỗ thông giữa hai ống để cho hai ống thông nhau. Thổi nhẹ muỗi từ ống nghỉ sang ống đối chứng trước và ống thử nghiệm sau. Đóng tấm đẩy lại, tháo ống nghỉ ra và đặt sang một bên.
+ Bước 5: Để các ống tiếp xúc dựng đứng, phía có lưới hướng lên trên trong thời gian tiếp xúc 60 phút, theo dõi và đếm số muỗi quỵ trong thời gian tiếp xúc (5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút và 60 phút).
+ Bước 6: Cuối thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi sang các ống nghỉ bằng các bước tiến hành ngược lại bước 4. Khi có một số muỗi bị ngã do tiếp xúc hóa chất những ống tiếp xúc sẽ được đặt nằm ngang và gõ nhẹ để muỗi tách ra khỏi tấm đẩy trước khi kéo tấm đẩy để tránh muỗi bị kẹt. Lắp ống nghỉ, mở tấm đẩy giữa và nhẹ nhàng thổi muỗi sang ống nghỉ, đóng tấm đậy lại và tháo ống tiếp xúc ra. Sau đó đặt ống nghỉ dựng đứng và đặt 1 tấm bơng có tẩm nước đường glucose 10% lên trên mặt lưới. Có thể dùng ly nhựa hoặc những dụng cụ thích hợp khác thay cho ống nghỉ miễn là những dụng cụ đó đảm bảo được tính tương thích.
+ Bước 7: Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, nhiệt độ không quá 300C, theo dõi nhiệt độ và ẩm độ trong suốt q trình thử nghiệm. Nếu khí hậu hanh khơ dùng khăn tẩm nước sạch hoặc khăn ướt phủ lên ống nghỉ. Giữ không để kiến vào ăn muỗi.
+ Bước 8: Sau 24 giờ tính số muỗi chết các lơ thử nghiệm. Con muỗi nào khơng bay được thì coi là muỗi chết dù chân, cánh, pal, vòi vẫn cử động. Kết quả thử nghiệm được ghi vào phiếu.
Hình 2.8. Đọc kết quả thử nghiệm nhạy cảm của muỗi Aedes với hóa chất
Phiên giải kết quả thử nghiệm [5].
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết lô đối chứng > 20% thì kết quả thử nghiệm không được chấp nhận. Cần phải tiến hành lại thử nghiệm.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng < 5%, giữ nguyên tỷ lệ chết của lơ tiếp xúc với hóa chất.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng 5- 20% thì tỷ lệ muỗi chết trong lơ thử nghiệm được điều chỉnh theo cơng thức Abbott:
% muỗi chết thí nghiệm – % muỗi chết đối chứng Tỷ lệ muỗi chết =
Sau 24 giờ, căn cứ trên tỷ lệ muỗi chết để đánh giá mức độ nhạy, kháng của muỗi với hóa chất theo các chỉ số sau:
+ Tỷ lệ muỗi chết ≥ 98%, muỗi cịn nhạy với hóa chất thử;
+ Tỷ lệ muỗi chết 80-97%, muỗi tăng sức chịu đựng với hóa chất.
+ Tỷ lệ muỗi chết < 80%, muỗi kháng hóa chất tại nồng độ thử.
2.5.8. Kỹ thuật xác định các đột biến gen liên quan đến kháng hóa chất của muỗi Ae. aegypti tại các điểm nghiên cứu của muỗi Ae. aegypti tại các điểm nghiên cứu
Kỹ thuật này được thực hiện tại Phịng thí nghiệm khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn nhằm xác định các đột biến tại vị trí domain II, đoạn 6 của muỗi Ae. aegypti thu thập từ các điểm nghiên cứu.
Các bước thực hiện như sau (chi tiết tại phụ lục 3):
- Kỹ thuật tách chiết ADN tổng số: Acid nucleic được tách chiết bằng bộ Kít DNeasy blood and tissue của hãng Qiagen và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Kỹ thuật PCR thu nhận gen kdr: thực hiện theo Kawada và cộng sự (2016) nhằm xác định các đột biến. Sử dụng cặp mồi AaSCF1 và AaSCR4 trên vùng gen có kích thước khoảng 650 bp thuộc exon 20 và exon 21 của gen quy định kênh Natri (Kawada và cộng sự 2016) [77].
AaSCF1: 5’-AGA CAA TGT GGA TCG CTT CC-3’ AaSCR4: 5’-GGA CGC AAT CTG GCT TGT TA-3’
- Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR: tinh sạch bằng bộ QIAquick PCR purification kit (Qiagen). Các bước thực hiện theo hướng dẫn của bộ kít.
- Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp: Sản phẩm PCR của gen kdr sau khi
được tinh sạch sẽ được giải trình tự trực tiếp bằng máy giải trình tự của hãng Beckman Coulter theo phương pháp của Sanger (1977).
- Phân tích trình tự: Ứng dụng các phần mềm sinh tin như GenomeLab GeXP, Geneous 8, so sánh dữ liệu gen trên ngân hàng gen để phân tích các trình tự nucleotide thu được gen kdr của muỗi Ae. aegypti.
2.6. Quy trình nghiên cứu
2.6.1. Nghiên cứu tại thực địa
Ở mỗi đợt điều tra, căn cứ vào danh sách hộ gia đình của điểm nghiên cứu, nhóm nghiên cứu chọn ngẫu nhiên nhà đầu tiên để điều tra. Sau khi chủ nhà đồng ý, nhóm nghiên cứu tiến hành chia làm hai phân nhóm gồm phân nhóm điều tra muỗi, bọ gậy trong nhà và phân nhóm điều tra muỗi, bọ gậy ngồi nhà. Nhóm nghiên cứu sử dụng ống tuýp để thu thập muỗi trưởng thành và ống hút, vợt để thu thập bọ gậy Aedes spp. Sau đó ghi tất cả các thông tin vào biểu mẫu đã thiết kế sẵn để điều tra tại thực địa.
Tất cả các mẫu muỗi trưởng thành và bọ gậy đều được định loại để xác định chính xác tên lồi. Mẫu muỗi và bọ gậy Aedes được mang về tại
phịng thí nghiệm khoa Cơn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn để xét nghiệm muỗi nhiễm virus Dengue và nuôi bọ gậy đến giai đoạn trưởng thành để phục vụ cho nghiên cứu thử nhạy cảm.
2.6.2. Nghiên cứu tại phịng thí nghiệm
Bọ gậy và muỗi mang về phịng thí nghiệm, sau đó muỗi trưởng thành được định loại lại một lần nữa dưới kính lúp để khẳng định chính xác tên lồi. Việc định loại này được thực hiện bởi các cán bộ đang làm việc tại tổ Côn trùng thực nghiệm - khoa Côn trùng tham gia nghiên cứu. Các mẫu bọ gậy tiếp tục nuôi đến giai đoạn trưởng thành để thử nhạy cảm.
Các mẫu muỗi trưởng thành thu thập tại thực địa nếu còn sống cho vào tủ lạnh gây chết lâm sàng. Sau đó các mẫu muỗi này cho vào tuýp
eppendorf (theo loài) ghi nhãn theo loài, địa điểm và thời gian thu thập. Số muỗi từng loài cho vào tuýp eppendorf từ không quá 20 cá thể. Muỗi trong tuýp eppendorf được nghiền trong dung dịch đệm và sẽ được dùng cho phương pháp xét nghiệm RT-PCR để xác định muỗi nhiễm virus Dengue.
Các mẫu muỗi Ae. aegypti sau khi thử nhạy cảm với hóa chất diệt cơn trùng, nếu cịn sống thì chúng được chọn để làm xét nghiệm phân tử để xác định các đột biến trên gen kdr của các quần thể muỗi kháng hóa chất.
2.7. Các biến số và chỉ số trong nghiên cứu 2.7.1. Các biến số trong nghiên cứu 2.7.1. Các biến số trong nghiên cứu
- Các biến số về cơn trùng gồm số muỗi, mật độ muỗi, nhà có muỗi, nhà có bọ gậy, chỉ số Breteau, số DCCN, số DCCN có bọ gậy.
- Biến số về xét nghiệm là số mẫu muỗi xét nghiệm virus Dengue, số mẫu muỗi phân tích và giải trình tự.
- Các biến số về thử nghiệm sinh học là số muỗi thử nghiệm ở các lô thử nghiệm và đối chứng.
+ Biến số về thời gian gồm mùa khô và mùa mưa cũng như sự thay đổi quần thể muỗi vào các tháng điều tra trong giai đoạn 2016-2018.