Tỉnh Huyện/TP Xã/phường Độ cao (mét) Tọa độ
Bình Định
Quy Nhơn Quang Trung
Ngơ Mây 8 13046'59" 109°10'51" Phù Cát Cát Trinh Ngô Mây 17 1400'18" 109°3'54" Vĩnh Thạnh Vĩnh Thịnh Vĩnh Thạnh 54 14 005'52" 108°47'10" Gia Lai Pleiku Yên Đỗ Diên Hồng 773 13058'50" 107°59'36" Đăk Pơ Cư An
Tân An 371
13057'51" 108°35'26" Kông Chro Yang Trung
Kông Chro 443
13057'50" 108°35'26"
- Điểm nghiên cứu tại tỉnh Bình Định thuộc miền Trung: chọn 3 huyện/thành phố thuộc tỉnh Bình Định gồm thành phố Quy Nhơn, huyện Phù Cát và huyện Vĩnh Thạnh đại diện cho các sinh cảnh như sau:
+ Sinh cảnh thành thị: chọn chủ đích phường Quang Trung và phường Ngơ Mây thuộc thành phố Quy Nhơn, nơi có mật độ dân số cao nhất tỉnh 1004,5 người/km2 và 100% người dân sống ở thành thị. Vị trí địa điểm nghiên cứu nằm ở tọa độ 13046'59" vĩ bắc và 109°10'51" kinh đông, với độ cao khoảng 8 m so với mực nước biển [13].
+ Sinh cảnh nông thôn đồng bằng (gọi tắt là sinh cảnh đồng bằng): chọn hai xã Cát Trinh và Ngô Mây thuộc huyện Phù Cát nơi có mật độ dân số trung bình 283 người/km2 và người dân sống chủ yếu ở nơng thơn. Vị trí điểm điều tra nằm ở tọa độ 1400'18" vĩ bắc và 109°3'54" kinh đông, với độ cao khoảng 17 m so với mực nước biển [13].
+ Sinh cảnh nông thôn miền núi: Chọn xã Vĩnh Thịnh và Vĩnh Thạnh thuộc huyện Vĩnh Thạnh đại diện cho sinh cảnh miền núi, nơi có địa hình đồi núi, có mật độ dân số thấp khoảng 40 người/km2 và người dân sống ở nông thôn. Điểm nghiên cứu nằm ở tọa độ 14005'52" vĩ bắc và 108°47'10" kinh đông, với độ cao khoảng 54 m so với mực nước biển. Địa điểm nghiên cứu này cách sinh cảnh thành thị khoảng 90km về hướng Đông Nam [13].
- Điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai thuộc khu vực Tây Nguyên: Gia Lai là một tỉnh miền núi với địa hình phức tạp và nhiều dân tộc anh em cùng sinh sống, nên phân chia sinh cảnh dựa trên phân chia vùng dân tộc thiểu số và miền núi của Chính phủ (2017) [15], cũng như căn cứ vào thảm thực vật, địa hình. Các huyện/thành phố được chọn gồm Pleiku, Đăk Pơ và Kông Chro.
+ Sinh cảnh thành thị: chọn phường Yên Đỗ và phường Diên Hồng thuộc thành phố Pleiku đại diện cho sinh cảnh thành thị, nơi người dân sống chủ yếu ở thành thị với mật độ dân số cao nhất tỉnh là 847,54 người/km2 và có cơ sở hạ tầng phát triển nhanh và mạnh so với các vùng khác. Đời sống của người dân chủ yếu là các hoạt động thương nghiệp và cán bộ công nhân viên chức. Khoảng các giữa các nhà điều tra sát nhau. Vị trí địa điểm điều tra nằm ở tọa độ 13058'50" vĩ bắc và 107°59'36" kinh đông, với độ cao khoảng 773 m so với mực nước biển [12],[15].
+ Sinh cảnh nông thôn miền núi khu vực 1 (gọi tắt là nông thôn 1): Chọn xã Tân An và xã Cư An thuộc huyện Đăk Pơ, đại diện cho nông thôn dân tộc miền núi khu vực 1, mật độ dân số trung bình 81,31 người/km2 và 100% người dân sống nông thôn. Khu vực này người dân sống chủ yếu dựa vào trồng các loại cây rau màu ngắn ngày và tốc độ đơ thị hóa diễn ra chậm. Điểm điều tra nằm ở 13057'51" vĩ bắc và 108°35'26" kinh đông, với độ cao khoảng 371 m so với mực nước biển [12].
+ Sinh cảnh nông thôn miền núi khu vực 2 (gọi tắt là nông thôn 2): Chọn xã Yang Trung và Kông Chro thuộc huyện Kông Chro đại diện cho sinh cảnh nông thôn miền núi khu vực 2, nơi có điều kiện sống khó khăn hơn so với khu vực 1, với nhiều dân tộc anh em cùng sinh sống và có mật độ dân số thấp 31,49 người/km2 và người dân sống ở nông thôn. Khu vực điểm điều tra, xung quanh được bao bọc bởi đồi núi và các vườn cây ăn quả, khoảng cách giữa các nhà điều tra xa hơn so với thành thị và nông thôn 1. Địa điểm nằm ở độ cao khoảng 443 m so với mực nước biển [12],[15].
Hình 2.2. Sơ đồ các điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai
2.1.3.2. Nghiên cứu phịng thí nghiệm
- Phịng thí nghiệm khoa Côn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn. Định loại, phân tích mẫu muỗi và bọ gậy thu thập ngồi thực địa mang về phịng thí nghiệm để nhân ni bọ gậy đến muỗi trưởng thành F1 để tiến hành thử nhạy cảm với hóa chất diệt cơn trùng.
Quần đảo hồng sa
Quần đảo trường sa
- Phịng thí nghiệm khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn và Viện Sốt rét-KST-CT Trung Ương.
+ Xác định tỷ lệ muỗi Aedes thu thập ở thực địa nhiễm virus Dengue. + Xác định tính nhạy kháng của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus tại các sinh cảnh.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Xác định loài Ae. aegypti và Ae. albopictus dựa vào các đặc điểm
hình thái ngồi của muỗi trưởng thành và bọ gậy.
- Nghiên cứu chỉ được tiến hành tại các điểm được chọn có chủ đích ở các sinh cảnh khác nhau thuộc tỉnh Bình Định và Gia Lai.
- Nghiên cứu các đột biến gen kdr chỉ được thực hiện ở các quần thể muỗi Ae. aegypti tại các sinh cảnh thuộc tỉnh Bình Định và Gia Lai.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
2.3.1.1. Thiết kế nghiên cứu cho mục tiêu 1
Nghiên cứu ngang mơ tả có phân tích
- Nghiên cứu tại thực địa: Nghiên cứu ngang mô tả với tổng cộng 10 đợt điều tra từ tháng 10/2016-4/2018 để xác định phân bố, tập tính, các chỉ số véc tơ và tập tính tại các sinh cảnh được chọn ở tỉnh Bình Định và Gia Lai, cũng như thu thập mẫu muỗi và bọ gậy Aedes. Chi tiết các tháng điều
tra tại thực địa cụ thể như sau: Năm 2016 điều tra vào tháng 10 và tháng 12; Năm 2017: tháng 2, 4, 6, 8, 10 và 12; Năm 2018: tháng 2 và tháng 4.
- Nghiên cứu tại phịng thí nghiệm: Mẫu muỗi thu thập ngoài thực địa đưa về phịng thí nghiệm khoa Cơn trùng và được bảo quản ở tủ lạnh âm
850C. Sau đó các mẫu muỗi này sẽ được tiến hành xét nghiệm bằng kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định tỷ lệ muỗi nhiễm virus Dengue. Bên cạnh đó bọ gậy thu thập ngồi thực địa mang phịng ni để ni.
2.3.1.2. Thiết kế nghiên cứu cho mục tiêu 2
Nghiên cứu ngang mơ tả có phân tích
- Sử dụng kỹ thuật thử nghiệm sinh học (bioassay) xác định mức độ nhạy cảm của muỗi truyền bệnh SXHD với hóa chất diệt cơn trùng nhóm pyrethroid và nhóm phospho hữu cơ. Kỹ thuật này được thực hiện tại phịng thí nghiệm khoa Cơn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn theo quy trình của Bộ Y tế năm 2010 [5].
- Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến trên gen kdr của các quần thể muỗi Ae. aegypti tại phịng thí nghiệm khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn và Viện Sốt rét-KST-CT Trung ương.
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
2.3.2.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho điều tra thực địa
- Cỡ mẫu: Số hộ gia đình cần điều tra để đánh giá sự phân bố, tập tính và đặc điểm sinh thái bọ gậy theo mẫu nghiên cứu cắt ngang mơ tả. Dựa vào quy trình điều tra của Bộ Y tế năm 2014 [6], số hộ điều tra cho mỗi điểm (xã/phường) là ít nhất 30 nhà. Trong nghiên cứu này, chọn 50 nhà cho mỗi xã/phường để điều tra, như vậy mỗi sinh cảnh điều tra 100 nhà cho hai xã/phường mỗi đợt điều tra. Tổng cộng chọn 6 xã/phường đại diện cho 3 sinh cảnh mỗi tỉnh. Như vậy, hai tỉnh điều tra tổng cộng 12 xã/phường.
- Cách chọn nhà điều tra:
Tại mỗi xã, phường chọn 50 hộ gia đình theo kỹ thuật “cổng liền cổng” như sau: Quy định hướng đi về bên phải, chọn ngẫu nhiên 1 hộ gia
đình trong danh sách hộ gia đình của xã, đây là hộ đầu tiên được chọn để điều tra. Hộ kế tiếp điều tra là hộ liền cổng về bên phải. Cứ như thế cho đến khi đủ 50 hộ trong 1 xã/phường. Nếu hộ vắng sẽ quay trở lại điều tra sau, nếu lần 2 vẫn khơng có thì lấy hộ tiếp theo cuối cùng.
2.3.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho kỹ thuật phịng thí nghiệm
- Cỡ mẫu để xác định tỷ lệ muỗi nhiễm virus Dengue: thu thập tất cả
các cá thể muỗi trưởng thành Ae. aegypti và Ae. albopictus tại thực địa ở các
điểm điều tra vận chuyển về phịng thí nghiệm. Mỗi cá thể cho vào từng tuýp eppendoft và ghi rõ tên loài, địa điểm và thời gian thu thập. Sau đó các mẫu muỗi này được xét nghiệm virus Dengue bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Cỡ mẫu thử nhạy cảm muỗi với hóa chất diệt cơn trùng: Thu thập bọ gậy Aedes mang về phịng thí nghiệm khoa Côn trùng, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-côn trùng Quy Nhơn. Sau đó nhân ni bọ gậy phát triển đến giai đoạn trưởng thành và những cá thể muỗi cái Ae. aegypti và Ae. albopictus
khoẻ mạnh, cơ thể nguyên vẹn được sử dụng để thử nhạy cảm của muỗi với hóa chất diệt cơn trùng. Số muỗi thử cho 1 tỉnh = 5 loại hóa chất x 150 cá thể mỗi loài x 3 sinh cảnh=2.250 cá thể.
Như vậy, tổng số muỗi cái Ae. aegypti cần thiết cho thử nghiệm hóa chất tại Bình Định là 2.250 cá thể, Gia Lai 2.250 cá thể. Tương tự số muỗi cái Ae. albopictus cần thiết cho thử nghiệm hóa chất tại Bình Định là 2.250 cá thể, Gia Lai 2.250 cá thể.
- Cỡ mẫu xác định các đột biến phân tử liên quan đến kháng hóa chất diệt cơn trùng của muỗi truyền bệnh SXHD. Tại mỗi sinh cảnh chọn ngẫu nhiên 25 cá thể muỗi Ae. aegypti còn sống sau khi thử nghiệm nhạy cảm với các hóa chất diệt cơn trùng.
Mỗi tỉnh có 3 sinh cảnh, thì số lượng cá thể muỗi Ae. aegypti cần là 75 cá thể. Tổng số cá thể muỗi cần phân tích các đột biến trên gen kdr liên quan đến kháng hóa chất cho cả hai tỉnh đối với loài Ae. aegypti là 150 cá thể.
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 1
- Điều tra sự phân bố muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus theo từng sinh cảnh và theo thời gian.
- Xác định và đánh giá các chỉ số của muỗi và bọ gậy Ae. aegypti và
Ae. albopictus trung bình theo sinh cảnh và theo thời gian tại các điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định và Gia Lai.
- Quan sát, mơ tả một số tập tính muỗi trú đậu trong và ngoài nhà, đậu trên các giá thể khác nhau của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus.
- Tìm hiểu đặc điểm ổ bọ gậy của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus
theo từng sinh cảnh.
- Phân tích yếu tố mùa ảnh hưởng đến DCCN có bọ gậy Ae. aegypti
và Ae. albopictus theo từng sinh cảnh.
- Xác định tỷ lệ muỗi trưởng thành Ae. aegypti và Ae. albopictus thu
thập ngoài thực địa nhiễm với virus Dengue.
2.4.2. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 2
- Xác định mức độ nhạy cảm của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus tại các sinh cảnh nghiên cứu của tỉnh Gia Lai và Bình Định với các hóa chất diệt côn trùng gồm alphacypermethrin 30mg/m2, lambdacyhalothrin 0,05%, deltamethrin 0,05%, permethrin 0,75% và malathion 5%.
- Xác định đột biến trên gen kháng ngã gục kdr ở các quần thể muỗi
Ae. aegypti đã kháng với hóa chất khi thử sinh học tại các sinh cảnh được
chọn thuộc tỉnh Bình Định và Gia Lai.
2.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.5.1. Kỹ thuật soi bắt muỗi ban ngày 2.5.1. Kỹ thuật soi bắt muỗi ban ngày
Mục đích: Xác định sự phân bố của muỗi truyền bệnh SXHD, một số tập tính và các chỉ số véc tơ cũng như thu thập mẫu muỗi để xác định tỷ lệ muỗi nhiễm virus Dengue tại các sinh cảnh được chọn.
Thời gian thực hiện từ 7 giờ đến 17 giờ [6].
Cách tiến hành: Mỗi nhóm điều tra gồm ít nhất ba người tiến hành soi nhà ngày. Người điều tra một tay cầm ống tube hoặc máy bắt muỗi một tay cầm đèn pin. Bắt đầu tìm muỗi từ cửa ra vào và đi dần vào trong, đến tất cả các phòng, vừa đi vừa rọi đèn vào tường, màn, rèm, quần áo, các vật treo trên tường, dưới gầm giường, bàn ghế.
Chú ý tìm những nơi ánh sáng yếu, nơi tập trung sinh hoạt gia đình như phòng ngủ, phòng khách, nhà tắm. Tiếp theo dùng tube cầm sẵn trên tay úp nhanh lên muỗi, di chuyển ngón tay trỏ xuống bịt ống tube lại không cho muỗi bay ra, sau đó dùng bơng nút ống lại.
Cùng lúc đó cũng tiến hành điều tra muỗi ngoài, tập trung những khu vực có bụi cây, các khu vực có DCCN.
Ghi vào nhãn: địa điểm, thời gian, giá thể đậu và nơi bắt muỗi.
2.5.2. Kỹ thuật điều tra bọ gậy Aedes
Được thực hiện vào ban ngày, song song với phương pháp soi bắt muỗi trong nhà ngày, với mục đích xác định nơi sinh sản của muỗi, các chỉ
Cách tiến hành: Sử dụng bộ dụng cụ điều tra côn trùng để thu thập bọ gậy Aedes trong tất cả DCCN ở hộ gia đình điều tra. Quan sát cả trong nhà và xung quanh nhà ở tất cả các DCCN để ghi nhận tất cả các DCCN có hoặc khơng có bọ gậy, chủng loại DCCN. Những DCCN có bọ gậy, bọ gậy sẽ được thu thập và vận chuyển về phịng ni của khoa Cơn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn để thực hiện nhân nuôi đến giai đoạn trưởng thành.
2.5.3. Kỹ thuật thu thập bọ gậy Aedes
(a) (b)
Hình 2.3.(a) Cách thu thập bọ gậy ở dụng cụ chứa nước nhỏ, (b) Cách thu thập bọ gậy ở dụng cụ chứa nước lớn [124].
Mục đích xác định nơi phát sinh nhiều muỗi nhất tại các điểm nghiên cứu. Đối với các DCCN lớn như bể nước, phuy thì dùng vợt có đường kính 22 cm để thu thập (vợt 5 vịng chuẩn và sau đó nhân với hệ quy đổi theo thể tích từng lồi) (hình 2.3b), còn đối với những DCCN nhỏ như lọ hoa, máng nước gia cầm, chum vại và phế thải thì tiến hành đổ vào khay nhỏ hoặc trực tiếp dùng ống hút bắt bọ gậy [124].
Bọ gậy sau khi thu thập xong được vận chuyển về phịng ni muỗi của khoa Côn trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn.
2.5.4. Kỹ thuật định loại muỗi và bọ gậy Ae. aegypti và Ae. albopictus
Sử dụng bảng định loại muỗi Aedes spp. của Vũ Đức Hương (1997) [27] và Leopoldo M. Rueda (2004) [84] để định loại hình thái ngồi của muỗi Aedes truyền bệnh SXHD.
Hình 2.4. Tấm lưng ngực của muỗi Ae. aegypti (a) và Ae. albopictus (b) [84]
Hình 2.5. Răng lược đốt bụng VIII của bọ gậy Ae. aegypti (a) và Ae. albopictus (b)
“Nguồn: Leoplodo, 2004”[84]
(a) (b)
2.5.5. Kỹ thuật xét nghiệm muỗi nhiễm virus Dengue
Mục đích: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tỷ lệ muỗi
Ae. aegypti và Ae. albopictus ở thực địa nhiễm virus Dengue [72],[81].
Cách tiến hành: Muỗi truyền bệnh SXHD thu thập ngoài thực địa trong quá trình điều tra tại từng điểm nghiên cứu được mang về phịng thí nghiệm và được định loại lại. Sau đó cho muỗi vào tube eppendorf theo từng lồi, mỗi tube khơng quá 20 cá thể muỗi trong một mẫu xét nghiệm. Sau đó mẫu muỗi trong tube eppendorf được nghiền trong dung dịch đệm. Dung dịch muỗi nghiền này sẽ được dùng trong kỹ thuật One step RT-PCR để xác định virus trên mẫu muỗi (chi tiết Phụ lục 2).
Sơ đồ thí nghiệm xác định muỗi Aedes nhiễm virus Dengue
2.5.6. Kỹ thuật nhân ni muỗi Aedes
Mục đích: Nhân ni đủ số lượng muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus
trưởng thành để thử nhạy cảm với các hóa chất diệt cơn trùng. Mẫu muỗi cái Aedes thu thập ngoài thực địa
Tách chiếc RNA virus
Sử dụng bộ kít “Viral RNA MiniKit” hãng Qiagen
Đọc kết quả sản phẩm sau khi chạy điện di Xác định nhiễm virus Dengue thông qua phương
Bọ gậy thu thập ngoài thực địa tại các điểm điều tra được chuyển ngay về phịng ni khoa Cơn trùng, sau đó cho bọ gậy vào các khay nuôi. Chú ý ghi rõ các thông tin về địa điểm, ngày tháng thu thập lên từng khay. Cho thức ăn vào từng khay nuôi bọ gậy và được nhân ni trong điều kiện phịng nuôi nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm 80-85% và chiếu sáng 10/24 giờ.
Hằng ngày kiểm tra và nhặt quăng từ khay nuôi bọ gậy cho vào cốc đặt trong các lồng nuôi riêng, khi quăng lột xác thành muỗi trưởng thành thì tiến hành định loại để xác định lồi muỗi Aedes. Muỗi Aedes 2-3 ngày tuổi cho đốt chuột nhắt trắng, sau khi hút máu 2-3 ngày cho muỗi đẻ vào miếng giấy thấm đặt sẵn trong lồng nuôi. Nhân nuôi đến thế hệ F1 và những cá thể muỗi cái khỏe mạnh sẽ được sử dụng để thử nhạy cảm.