Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Độ nhạy cảm của muỗi Aedes với hóa chất diệt cơn trùng tại tỉnh Bình
3.2.3. Đột biến gen kdr liên quan đến tính kháng hóa chất diệt cơn trùng
của muỗi Ae. aegypti tại Bình Định và Gia Lai, 2016-2018.
3.2.2.1. Số lượng và tỷ lệ mẫu muỗi Ae. aegypti xuất hiện đột biến
Bảng 3.34. Tỷ lệ muỗi Ae. aegypti xuất hiện đột biến gen kdr
Tỉnh Chủng muỗi Thế hệ muỗi Đột biến gen kdr Số lượng Tỷ lệ % Bình Định Thành thị F1 (n=25) 13 52 Đồng bằng F1 (n=25) 12 48 Miền núi F1 (n=25) 7 28 Gia Lai Thành thị F1 (n=25) 14 56 Nông thôn 1 F1 (n=25) 12 48 Nông thôn 2 F1 (n=25) 8 32
Tỉnh Bình Định, tỷ lệ xuất hiện đột biến gen kdr cao nhất ở quần thể muỗi Ae. aegypti thành thị với tỷ lệ 52%, tiếp đến là quần thể Ae. aegypti
đồng bằng 48% và thấp nhất là muỗi Ae. aegypti miền núi với tỷ lệ mẫu đột biến là 28%. Tương tự tại Gia Lai, tỷ lệ muỗi xuất hiện đột biến cao nhất xảy ra ở quần thể muỗi thành thị 56% và nông thôn 1 là 48% và quần thể muỗi nông thôn 2 tỷ lệ mẫu xuất hiện đột biến thấp nhất với 32% (bảng 3.34).
Bảng 3.35. Phân bố các đột biến gen kdr của các quần thể muỗi Ae. aegypti
Tỉnh Chủng muỗi Các loại đột biến gen kdr
L982W V1016G Bình Định Thành thị + + Đồng bằng + + Miền núi + - Gia Lai Thành thị + - Nông thôn 1 + - Nông thôn 2 + -
Tại tỉnh Bình Định, có hai quần thể muỗi Ae. aegypti thành thị và
đồng bằng xuất hiện cả hai đột biến gen kdr là L982W và V1016G, còn sinh cảnh miền núi thì chỉ phát hiện đột biến L982W.
Ở Gia Lai, quần thể muỗi Ae. aegypti thành thị, nông thôn 1 và nông thôn 2 chỉ xuất hiện một đột biến là L982W (bảng 3.35).
Bảng 3.36. Tỷ lệ các đột biến gen kdr của muỗi Ae. aegypti theo sinh cảnh
Tỉnh Chủng muỗi Ae. aegypti Số mẫu đột biến L982W V1016G L982W + V1016G Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Bình Định Thành thị 13 7 53,8 5 38,5 1 7,7 Đồng bằng 12 6 50,0 6 50,0 0 0 Miền núi 7 7 100 0 0 0 0 Gia Lai Thành thị 14 14 100 0 0 0 0 Nông thôn 1 12 12 100 0 0 0 0 Nông thôn 2 8 8 100 0 0 0 0
Phân tích hai loại đột biến tại các điểm nghiên cứu cho thấy: Tại tỉnh Bình Định, sinh cảnh thành thị trong số 13 mẫu ghi nhận đột biến thì tỷ lệ đột biến L982W chiếm 53,8% so với đột biến V1016G là 38,5%, đồng thời tại sinh cảnh thành thị cũng ghi nhận 1 mẫu xuất hiện cùng lúc hai đột biến L982W + V1016G chiếm tỷ lệ 7,7%.
Tại sinh cảnh đồng bằng tỉnh Bình Định, tỷ lệ đột biến L982W và V1016G lần lượt là 50% và 50%; còn ở sinh cảnh miền núi 100% mẫu xuất hiện đột biến L982W (bảng 3.36).
Tỉnh Gia Lai, tại tất cả các sinh cảnh thành thị, nông thôn 1 và nơng thơn 2 có 100% đột biến L982W (bảng 3.36).
3.2.2.2. Kết quả PCR thu nhận gen kdr của muỗi Aedes aegypti
Các mẫu muỗi Ae. aegypti kháng hóa chất sau khi thử sinh học được tiếp tục thực hiện phản ứng PCR để thu nhận gen mã hóa vùng kdr, với kích thước lý thuyết là khoảng 650bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR đúng như dự kiến là 650bp và có chất lượng đủ để giải trình tự (hình 3.16)
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen kdr muỗi Aedes aegypti tại các điểm nghiên cứu
Ghi chú: (-); chứng âm; 1,2,7-31: sản phẩm điện di gen kdr muỗi Ae. aegypti với kích thước khoảng 650bp; M: thang chuẩn là ladder 100bp của hãng Promega.
3.2.2.3. Kết quả giải trình tự gen kdr của Ae. aegypti
Kết quả đo nồng độ DNA dao động trong khoảng từ 30 ng/µl đến 50 ng/µl và kết quả độ tinh sạch A260/280 nằm trong khoảng 1,8-2.
Sản phẩm PCR của gen kdr sau khi được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp trên máy Beckman Coulter, kết quả được trình bày trong hình dưới đây.
Hình 3.17. Kết quả giải trình tự gen kdr muỗi Ae. aegypti
Các trình tự thu nhận được từ các mẫu đã nhân bản thành công gen
kdr được kiểm tra bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen. Kết quả
cho thấy đây là trình tự của đoạn gen kdr.
3.2.2.2. Phân tích so sánh trình tự gen mã hóa cho kdr của muỗi Ae. aegypti
Sau khi giải trình tự và xác định các trình tự thu được đúng là đoạn gen kdr, các chuỗi nucleotide của đoạn gen kdr của muỗi Ae. aegypti tại các
điểm nghiên cứu được phân tích, so sánh với nhau và so sánh với các trình tự kdr của các chủng Ae. aegypti đã công bố trên ngân hàng gen, cụ thể mẫu tham chiếu ở đây là trình tự gen kdr hồn chỉnh của chủng Ae. aegypti cịn nhạy với hóa chất có ký hiệu trên ngân hàng gen là AB909019.1. Kết quả được trình bày dưới đây.
Hình 3.18. Phân tích một phần trình tự gen kdr của muỗi Ae. aegypti dưới dạng nucleotide và mẫu cịn nhạy với hóa chất nhóm pyrethroid.
So sánh phân tích các chuỗi gen thu được cho thấy trình tự nucleotide gen mã hóa đoạn exon 20 và exon 21 cho kênh natri tại vị trí gắn
của nhóm pyrethroid của các mẫu muỗi Ae. aegypti tại các điểm nghiên cứu có 2 vị trí sai khác dẫn đến thay đổi acid amin so với các mẫu tham chiếu.
Sau khi thu được kết quả so sánh phân tích vùng gen kdr Ae. aegypti của muỗi của các mẫu thu thập tại các điểm nghiên cứu, các chuỗi nucleotide được dịch mã thành các trình tự ở dạng acid amin cũng bằng phần mềm Geneious R8 (Hình 3.19).
Hình 3.19. Phân tích một phần trình tự gen kdr của muỗi Ae. aegypti dưới dạng acid amin và mẫu cịn nhạy với hóa chất nhóm pyrethroid
Kết quả so sánh về nucleotide trên vùng gen mã hóa đoạn exon 20 và exon 21 của gen kdr có 4 vị trí sai khác về nucleotide, trong đó 2 vị trí có sự