Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) xây dựng qui trình nhân nuôi và tinh chế virút dengue sử dụng trong sản xuất vắc xin sống giảm độc lực (Trang 46 - 48)

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số

lượng tế bào Vero trên chai nuơi một lớp hoặc chai Cell factory

Nguyên tắc

Tế bào Vero được cất giữ trong mơi trường cĩ huyết thanh và chất bảo quản DMSO, chất bảo quản này giúp cho tế bào khơng bị chết khi cất giữ ở nhiệt âm sâu (nitơ lỏng -196 °C), nhưng đồng thời cũng là chất cĩ thể gây độc tế bào khi chuyển lại điều kiện nuơi cấy bình thường. Các ống tế bào sẽ được đơng tan nhanh trong nước ấm (37oC) và chuyển vào trong mơi trường nuơi cấy, mơi trường với DMSO tồn dư được loại bỏ sau 1 ngày. Tế bào sau khi nhân lên phủ kín bề mặt chai sẽ được tách chuyển tiếp sang các chai nuơi mới.

Các bước tiến hành

a. Cấy chuyển tế bào từ điều kiện bảo quản ra chai nuơi cấy một lớp

- Hút chuyển 24 ml mơi trường MEM 10 % FBS vào chai nuơi tế bào 75 cm2, làm ấm mơi trường bằng bể ổn nhiệt tại 37 oC, 10 phút.

- Lấy ống tế bào Vero bảo quản trong N2 lỏng, cho nhanh vào cốc nước 37 oC. - Khi hỗn dịch trong ống tế bào tan hồn tồn, hút tồn bộ hỗn dịch, từ từ chuyển vào trong chai nuơi tế bào cĩ mơi trường đã được làm ấm. (Thực hiện trong tủ an tồn sinh học)

- Lắc nhẹ chai cho tế bào lan đều bề mặt, chuyển vào tủ ấm 37oC.

- Sau 24 giờ, kiểm tra mức độ bám của tế bào Vero trên bề mặt chai, hút bỏ tồn bộ mơi trường cũ (cĩ chứa DMSO), chuyển 25ml mơi trường MEM 10%FBS đã làm ấm vào các chai.

- Tiếp tục nuơi và theo tế bào tại 37oC từ 3-5 ngày.

b. Cấy chuyển, nhân thêm tế bào trên chai nuơi cấy một lớp

- Kiểm tra chai tế bào (nuơi từ 2-3 ngày) trước khi tiến hành: mơi trường nuơi cấy trong suốt, màu đỏ cam, tế bào phủ kín 90-100% bề mặt (hình 2.1). - Ủ ấm mơi trường MEM 10% FBS, Trypsin và PBS trong 37oC từ 15 đến 30

phút.

- Hút sạch tồn bộ nước nổi trong các chai tế bào.

- Chuyển 10 ml PBS vào trong chai tế bào (75 cm2). Tráng rửa bề mặt rồi hút bỏ tồn bộ PBS.

- Lặp lại bước trên thêm 1 lần.

- Chuyển 1 ml dung dịch Trypsin 0.25% vào trong chai tế bào (75 cm2), láng đều bề mặt.

- Ủ các chai trong 37oC từ 3-5 phút, soi kính hiển vi kiểm tra tế bào tách khỏi bề mặt chai.

- Vỗ nhẹ vào thành chai cho tế bào tách hồn tồn.

- Chuyển 9 ml mơi trường MEM 10% FBS vào chai tế bào để trung hịa trypsin. - Lấy mẫu hỗn dịch tế bào để đếm bằng buồng đếm tế bào. Tính mật độ tế bào

trong hỗn dịch tế bào thu được.

- Chuyển tế bào trong hỗn dịch thu được vào mỗi chai nuơi cấy một lớp mới hoặc chai Cell Factory với mật độ tế bào từ 2,5 – 3,5x 104 tế bào/ cm2.

- Thêm mơi trường MEM 10% FBS vừa đủ với tỉ lệ thể tích 0,33 ml/ cm2 vào mỗi chai.

- Chuyển các chai nuơi cấy tế bào mới vào tủ ấm 37oC, theo dõi từ 2-3 ngày.

Hình 2.1. Tế bào Vero sau khi nuơi cấy.

A: Sau 1 ngày, B: sau 2 ngày, C: Sau 3 ngày.

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) xây dựng qui trình nhân nuôi và tinh chế virút dengue sử dụng trong sản xuất vắc xin sống giảm độc lực (Trang 46 - 48)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(96 trang)