1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
3.1 Xây dựng quy trình nhân nuơi virút dengue ở quy mơ phịng thí nghiệm
3.1.3 Quy trình nhân nuơi virút dengue ở quy mơ phịng thí nghiệm
Dựa trên kết quả khảo sát liều gây nhiễm, thời gian hấp phụ, thời gian nuơi cấy virút và số lượng các mẻ gặt cần thiết, chúng tơi xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất chủng virút gốc giống cho sản xuất vắc xin dengue như sau:
Hình 3.8. Sơ đồ tĩm tắt quy trình nhân nuơi virút dengue
Để đảm bảo yêu cầu sử dụng cho sản xuất vắc xin, hỗn dịch nước nổi virút sau thu hoạch phải đảm bảo khơng tạp nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma, mycobacteria hoặc nhiễm chéo các chủng virút dengue khác. Do đĩ tất cả các bước trong quy trình nuơi cấy tế bào, virút đều được tiến hành trong khu vực kiểm sốt (class C) và trong các tủ an tồn sinh học (class A) đảm bảo vơ trùng, được kiểm tra và thẩm định
Thu hoạch các chủng virus dengue
Thu hoạch nước nổi và bổ sung mơi trường LH3E mới và tiếp tục nuơi cấy. Các mẻ gặt sau cách nhau 3 ngày.
Ủ các chai trong tủ ấm
Nhiệt độ 37± 0.5oC; 5 ± 0.5% CO2 trong 7 ngày
Bổ sung mơi trường nuơi cấy khơng huyết thanh
Mơi trường LH3E 0,33ml/cm2
Gây nhiễm virus dengue
Liều gây nhiễm MOI = 0.01; thời gian hấp phụ 1 giờ
thường xuyên bởi phịng quản lý chất lượng. Nước nổi sau thu hoạch của tất cả các mẻ gặt đều được lưu mẫu và tiến hành kiểm tra vơ khuẩn (xem phần 2.2.10). Ngồi ra, dựa trên cơng thức pha dự kiến cho các chủng dengue từ 103 – 104 PFU/ml, và để thuận lợi cho qui trình tinh chế virút sau này, hiệu giá virút của tất cả các chủng, và các mẻ gặt phải đạt trên 106 PFU/ml. Kết quả kiểm tra chất lượng các mẻ gặt của các chủng virút dengue được tổng hợp theo bảng dưới đây:
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng các mẻ gặt đơn virút dengue
Chủng virút
Mẻ gặt
Hiệu giá virút (Log PFU/ml) Thử nghiệm vơ khuẩn
Kết luận
Tiêu chuẩn cơ sở Kết quả
rDEN 1 H1 6.0 7.42 Đạt Đạt H2 6.0 7.12 Đạt Đạt H3 6.0 6.65 Đạt Đạt rDEN 2 H1 6.0 7.24 Đạt Đạt H2 6.0 7.15 Đạt Đạt H3 6.0 6.73 Đạt Đạt rDEN 3 H1 6.0 6.65 Đạt Đạt H2 6.0 6.70 Đạt Đạt H3 6.0 6.31 Đạt Đạt rDEN 4 H1 6.0 8.09 Đạt Đạt H2 6.0 8.12 Đạt Đạt
Đối với qui trình sản xuất trên đây, qui mơ cĩ thể mở rộng bằng cách tăng số lượng tầng trên chai nuơi, hoặc tăng số lượng chai nhiều tầng để đảm bảo lượng virút cần thiết theo yêu cầu trong 1 loạt sản xuất mà khơng cần phải thay đổi nền tảng nuơi cấy tế bào hoặc thay đổi qui trình sản xuất.