1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
2.2 Phương pháp
2.2.2 Phương pháp gây nhiễm và nuơi cấy virút dengue trên tế bào
Nguyên tắc
Để đảm bảo cho virút nhân lên hiệu quả trong tế bào, quá trình gây nhiễm sẽ được tiến hành khi tế bào đang ở pha sinh trưởng, phủ kín 90% đến 95% bề mặt chai. Khảo sát liều gây nhiễm và mơi trường phù hợp để đạt hiệu giá virút sau nuơi cấy tốt nhất.
Các bước tiến hành
- Làm ấm mơi trường khơng huyết thanh, PBS ở 37oC.
- Kiểm tra mức độ phủ kín của tế bào Vero trên bề mặt chai (từ 85% đến 95%). - Tách 2-3 chai tế bào để đếm và tính số lượng tế bào trong mỗi chai (xem phương
pháp cấy chuyển tế bào) từ đĩ tính lượng tế bào cĩ trong chai CF10. Tính lượng virút dengue cần để gây nhiễm theo cơng thức dưới đây:
Trong đĩ: X là thể tích hỗn dịch virút cần gây nhiễm cho một chai tế bào (ml). A là tổng số tế bào trong một chai tế bào trên chai cần gây nhiễm. B là hiệu giá của chủng sản xuất trong 1ml (PFU/ml)
MOI là liều gây nhiễm tính theo số virút gây nhiễm cho 100 tế bào
- Pha lỗng X (ml) virút dengue tính ở trên trong 400 ml mơi trường khơng huyết thanh cho mỗi chai Cell Factory 10 tầng (CF10), tương đương 40 ml/ tầng (1 tầng chai CF10 CORNING cĩ diện tích 636 cm2). Ví dụ: với liều gây nhiễm MOI = 0,01, 1,2x109 tế bào/chai CF10, hiệu giá virút 106 PFU/ml thì thể tích virút (X) cần cho mỗi chai sẽ là 12 ml.
- Tráng rửa mỗi chai tế bào CF10 bằng 800 ml mơi trường khơng huyết thanh. - Bổ sung 400 ml hỗn dịch virút sau pha lỗng vào mỗi chai.
X =
AxMOI B
- Láng đều bề mặt, ủ các chai 37oC trong khoảng 1 – 2 giờ. Lắc đều chai nuơi cấy sau mỗi 15 phút ủ.
- Bổ sung vào mỗi chai 1600 ml mơi trường khơng huyết thanh. - Ủ nuơi các chai trong tủ ấm 37 0.5oC; 5 0.5% CO2 từ 5-8 ngày.