1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
2.2 Phương pháp
2.2.11 Phương pháp định lượng DNA tổng số bằng phương pháp lai phân tử
Nguyên tắc
Các phân tử DNA sẽ được ngây biến tính, cố định trên màng, và tiến hành lai với các đầu dị DNA đặc hiệu cĩ gắn Biotin. Sau quá trình lai này, màng lai sẽ được rửa các DNA khơng bắt cặp đặc hiệu và được áp vào một tấm phim nhạy cảm ánh sáng. Dựa trên kích thước của các chấm đen xuất hiện trên phim so sánh với các mẫu chuẩn để xác định hàm lượng DNA tồn dư của tế bào.
Các bước tiến hành
+ Chia mẫu ra các týp, mỗi týp cĩ 0,5ml mẫu. + Mỗi týp thêm vào:
50 ml dung dịch 10% SDS
10 ml dung dịch Proteinase-K 20mg/ml
+ ủ trong bể ủ nhiệt 450C qua đêm.
+ Thêm 560 ml phenol:chloroform, trộn đều. Ly tâm 3000 rpm trong 15 phút, chuyển lớp trên sang týp mới. Lặp lại bước trên một lần nữa.
+ Thêm 56 ml dung dịch sodium acetate 3M, trộn đều. Thêm 1,2 ml dung dịch ethanol bão hịa. Trộn đều và ủ tại -200C trong 30 phút.
+ Ly tâm 13.000 rpm trong 15 phút.
+ Loại nước nổi, rửa bằng 500 ml dung dịch ethanol 70%, ly tâm 13.000 rpm trong 15 phút. Lặp lại bước trên 1 lần.
+ Loại nước nổi, để khơ, hịa cặn trong 50 ml TE buffer, giữ tại -200C. b) Nhỏ mẫu lên màng
- ADN chuẩn được pha từ ADN tế bào Vero trong đệm TE ở các nồng độ 10ng/l, 1ng/l, 0,1ng/l, 0,01ng/l, 0.001ng/l.
- Làm biến tính DNA mẫu và DNA chuẩn ở 95 oC trong 5 phút, ủ trong đá 10 phút.
- Lắp màng vào máy bio-dot.
- Cho 100 ml TE vào tất cả các ơ trên màng, rút ra từ từ bằng cách cho áp lực nhẹ.
- Nhỏ 100 ml mẫu vào giếng, những giếng trống thì nhỏ 100 ml buffer TE. - Bật máy hút chân khơng, dung dịch chạy qua hết, đĩng van.
- Cho máy hút chân khơng lần nữa
- Lấy màng ra. Cố định 2 mặt bằng tia UV, mỗi mặt 2 phút. c) Chuẩn bị dung dịch tiền lai
+ Chuẩn bị 10 ml dung dịch tiền lai: dùng pipet hút lần lượt các hĩa chất sau cho vao ống ly tâm 50 ml:
+ SSC 20X 3ml + Dung dịch Denhardt 100X 0,5 ml
+ Dung dịch 10% SDS 0,5 ml
+ ADN tinh hồn cá hồi 0,1 ml (đã biến tính)
+ 50% Formamide 5 ml
+ Nước đã khử nuclease 0,9 ml + Dung dịch tiền lai được lọc qua màng 0,45 mm.
d) Chuẩn bị dung dịch lai (chuẩn bị trước khi lai)
+ Làm biến tính 10l ADN gắn biotin trong 10 phút ở 95 oC sau đĩ để trong đá 10 phút.
+ Chuẩn bị 10 ml dung dịch lai: dùng pipet hút lần lượt các hĩa chất sau cho vao ống ly tâm 50 ml:
SSC 20X 3ml
+ Dung dịch Denhardt 100X 0,5 ml
+ Dung dịch 10% SDS 0,5 ml
+ ADN tinh hồn cá hồi 0,1 ml (đã biến tính)
+ 50% Formamide 5 ml
+ ADN gắn Biotin 10 ml (đã biến tính) + Nước đã khử nuclease 0,9 ml
- Dung dịch lai được lọc qua màng 0,45 mm. e) Lai ADN dị với ADN Mẫu
- Cho dung dịch tiền lai vào ống lai
- Ngâm màng trong dung dịch tiền lai (20-100l/cm2) - ủ trong tủ lai ở 42oC trong 4 giờ, lắc nhẹ.
- Loại bỏ dung dịch tiền lai, thay bằng dung dịch lai, ủ ở 42oC qua đêm, lắc nhẹ
- Hút bỏ dung dịch lai.
- Rửa 2 lần bằng 30ml SSC 2X/ SDS 0,1 % trong 5phút ở nhiệt độ phịng. - Rửa 2 lần bằng 30ml SSC 0.25X/ SDS 0,1 % 5phút ở nhiệt độ phịng. - Rửa 2 lần bằng 30ml SSC 0.16X/SDS 0,1 % trong 15phút ở 65 oC - Tráng lại bằng SSC 2X trong 30 giây ở nhiệt độ phịng
g) Phát hiện Biotin gắn ADN
- Bão hịa trong dung dịch blocking (0,1ml/cm2), lắc 5 phút.
- Pha lỗng Streptavidine trong dung dịch blocking tỉ lệ 1:1000 (0,05 ml/cm2), lắc nhẹ 5 phút.
- Rửa màng 2 lần trong dung dịch rửa I (0,5 ml/cm2), mỗi lần lắc 5 phút. - Pha lỗng Biotin-alkaline phosphate trong dung dịch blocking tỉ lệ 1:1000
(0,05 ml/cm2), lắc nhẹ 5 phút.
- Rửa màng với dung dịch rửa I (0,5 ml/cm2), mỗi lần lắc 5 phút.
- Rửa màng 2 lần trong dung dịch rửa II (0,5 ml/cm2), mỗi lần lắc 5 phút. - Nhỏ dung dịch CDP-Star (25ml/2,5ml buffer) lên màng (0,025 ml/cm2), lắc
nhẹ 5 phút.
- Loại hồn tồn dung dịch.
- Bọc nilon rồi ép phim, thời gian khoảng 2 phút. - Rửa phim.
h) Kết quả
Dựa vào độ phát quang hoặc màu của mẫu thử so với mẫu chuẩn để tính hàm lượng ADN tồn dư của mẫu.
3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN