1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.4 Đặc điểm chủng vắc xin dengue tái tổ hợp được sử dụng tại VABIOTECH
Viện Quốc Gia các bệnh di ứng và nhiễm trùng (NIAID) thuộc viện NIH, Hoa Kỳ đã nỗ lực tiến hành các nghiên cứu phát triển vắc xin dengue trong hơn 15 năm qua. Các chủng virút giảm độc lực được phát triển dựa trên cơng nghệ DNA tái tổ hợp bằng phương pháp thiết kế trực tiếp thơng qua hai chiến lược giảm độc lực chính bao gồm: tạo ra các đột biến mất nucleotide trong vùng khơng dịch mã và tạo virút ở dạng khảm. Cả hai chiến lược này đều tạo ra các đột biến khơng cĩ khả năng phục hồi, đảm bảo tính ổn định di truyền chủng, khả năng tái độc rất thấp do đĩ tính an tồn của vắc xin sẽ cao hơn so với cơng nghệ giảm độc lực thơng qua cấy truyền nhiều đời. Cấu trúc vùng 3’ khơng dịch mã (3’-UTR) virút dengue cĩ tính bảo thủ cao giữa các tuýp huyết thanh khác nhau. Mặc dù các nucleotide riêng lẻ trong vùng
này ít bảo thủ, tuy nhiên cấu trục cuộn vịng tạo bởi các nucleotide lại cĩ tính bảo thủ cao, và đây là cơ sở cho các nghiên cứu gây đột biến giảm độc lực tại NIH.
Hình 1.11. Sơ đồ hệ gen các chủng dengue tái tổ hợp được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực tại VABIOTECH
Chủng virút tái tổ hợp rDEN 1 được phát triển dựa trên cấu trúc tồn bộ hệ gen DEN 1 chủng Tây Thái Bình Dương, được làm giảm độc lực thơng qua đột biết mất đoạn 30 nucleotide vùng 3’-UTR từ vị trí 172-143. Tương tự như vậy chủng virút tái tổ hợp rDEN 4 được phát triển trên cấu trúc hệ gen chủng DEN4 Dominica/81 strain 814669 [21]. Chủng virút tái tổ hợp rDEN 2 được phát triển dựa trên việc thay thể vùng mã hĩa prM và E của rDEN4∆30 bằng các vùng mã hĩa tương ứng từ chủng DENV-2 NGC, tạo ra virút khảm rDEN2/4∆30(ME) [13]. Chủng virút tái tổ hợp rDEN 3 được phát triển dựa trên cấu trúc tồn bộ hệ gen chủng DENV-3 Slemen/73 hoang dại được gây đột biết mất đoạn ∆30 tương tự các chủng trên và thêm một đột biến mất 31 nucleotide ở 3’-UTR ở vị trí 55 nucleotide phía trên của đột biến ∆30 [14] (Hình 1.11). Các chủng vắc xin dự tuyển đơn lẻ đều được đánh giá tiền lâm sàng trên mơ hình chuột hepatoma và trên khỉ nhằm xác định mức độ giảm độc lực của virút cũng như hiệu quả sinh đáp ứng miễn dịch trước khi tiến hành các nghiên cứu lâm sàng trên người.
So với các vắc xin sống giảm độc lực đang được phát triển khác, NIH là đơn vị duy nhất tiến hành các nghiên cứu lâm sàng các vắc xin đơn giá dự tuyển độc lập trước khi đánh giá lâm sàng vắc xin tứ giá. Kết quả của các nghiên cứu này giúp các nhà khoa học đánh giá được hiệu quả trung hồ của kháng thể đặc hiệu, kháng thể chéo giữa các chủng, liều gây nhiễm 50% trên người (HID50) cũng như lựa chọn các chủng vắc xin đơn giá dự tuyển tốt nhất cho các nghiên cứu tiếp theo [45]. Ngồi ra, trong thành phần vắc xin TV003/TV005 cĩ chứa các protein phi cấu trúc tự nhiên của ba trong bốn týp huyết thanh DEN do đĩ ngồi khả năng tạo các kháng thể trung hồ, vắc xin cịn giúp tạo đáp ứng miễn dịch tế bào T thơng qua việc hoạt hố tế bào CD8+ chống lại các epitope đặc hiệu trên thành phần protein phi cấu trúc của virút (Hình 1.12). Các nghiên cứu lâm sàng vắc xin TV003 đã cho thấy, các đáp ứng CD8+ tế bào T được tạo ra giúp bảo vệ chéo chống lại các epitope cĩ tính bảo tồn cao giữa các týp huyết thanh do đĩ cĩ tiềm năng bảo vệ người tình nguyện khỏi các trường hợp tăng nặng của bệnh [64]. Đây cũng là sự khác biệt quan trọng mà các vắc xin sống giảm độc lực dự tuyển khác khơng cĩ được.
Hình A
Hình 1.12. Sơ đồ cấu trúc các chủng vắc xin dự tuyển tái tổ hợp TV003/005 so sánh với vắc xin Denvaxia
Hình B
A. Cấu trúc thành phần vắc xin TV003/TV005 do NIH phát triển cĩ chứa các
protein phi cấu trúc tự nhiên của 3 trên 4 tuýp huyết thanh.
B. Thành phần vắc xin Dengvaxia được phát triển dựa trên giá thể virút sốt vàng da, được thay thế gen vùng mã hĩa prM và E của các chủng DEN
tương ứng (khơng chưa các thành phần protein phi cấu trúc của DEN).
Dựa trên các đánh giá về ưu nhược điểm của các chủng dengue tái tổ hợp và các kết quả lâm sàng rất hứa hẹn của vắc xin TV003/TV005 (xem phần 1.3.1.2), cơng ty VABIOTECH đã hợp tác nhận chuyển giao các chủng dengue tái tổ hợp thuộc 4 týp huyết thanh của phịng thí nghiệm bênh truyền nhiễm NIH, Hoa Kỳ để đưa vào nghiên cứu, phát triển vắc xin dengue tại Việt Nam. Hiện tại, VABIOTECH đã hồn thành việc xây dựng ngân hàng tế bào Vero, và hệ thống chủng gốc giống đảm bảo chất lượng. Đây là tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu phát triển và tối ưu hố qui trình sản xuất vắc xin sau này. Với mục tiêu phát triển được vắc xin dengue tứ giá sống giảm độc lực an tồn, hiệu quả với một liều tiêm duy nhất, phù hợp với nhiều lứa tuổi. Ngồi ra qui trình sản xuất vắc xin phải đảm bảo giá thành rẻ, cĩ khả năng cung ứng hàng triệu liều vắc xin dengue, các nghiên cứu các thơng số phù hợp để gây nhiễm và nhân nuơi virút với số lượng lớn, cũng như thiết lập được qui trình tinh chế vắc xin đạt hiệu quả cao và ổn định là rất cần thiết. Việc xây dựng thành cơng qui trình sản xuất vắc xin là bước tiến quan trọng giúp VABIOTECH làm chủ được hồn tồn về mặt cơng nghệ sản xuất vắc xin dengue tại Việt Nam, nhanh chĩng đáp ứng được yêu cầu cấp thiết trong việc phịng chống dịch bệnh dengue. Gĩp phần đẩy lùi dịch bệnh một cách chủ động và hiệu quả hơn, giúp nâng cao chất lượng chăm sĩc sức khoẻ cộng đồng tại Việt Nam.
2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
2.1.1 Tế bào Vero
Tế bào Vero được sử dụng trong nghiên cứu này thuộc đời thứ 142 lấy từ ngân hàng tế bào của Cơng ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1. Ngân hàng tế bào Vero được nuơi cấy từ nguồn tế bào của TCYTTG đảm bảo đầy đủ yêu cầu về tiêu chuẩn chất lượng.
2.1.2 Các chủng virút dengue tái tổ hợp
Chủng virút dengue tái tổ hợp: rDEN 1; rDEN 2; rDEN 3; rDEN 4 thuộc hệ thống ngân hàng chủng sản xuất WSV do VABIOTECH sản xuất, đã được kiểm tra và đạt các tiêu chuẩn chất lượng vơ khuẩn, yếu tố ngoại lai, ổn định di truyền và hiệu giá. Các ống chủng hiện được bảo quản trong điều kiện -70oC đến -80oC, cĩ hiệu giá từ 106.5 đến 107.5 pfu/ml, đảm bảo yêu cầu làm nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất vắc xin theo các khuyến cáo của WHO [66].
2.1.3 Mơi trường nuơi cấy và các dung dịch trong nghiên cứu
2.2.3.1 Mơi trường cĩ huyết thanh
- Mơi trường MEM 10% FBS: được pha chế và sản xuất theo tiêu chuẩn tại VABIOTECH từ MEM (GIBCO) dạng bột, sau đĩ mơi trường được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FBS) cùng các chất kháng sinh (Kanamycin), kháng nấm (Funzizone).
- Mơi trường MEM 2 % FBS + 1 % methycellulose: là mơi trường MEM cĩ bổ sung 2% FBS cùng 1% Methylcellulose, sử dụng phủ phiến sau khi gây nhiễm virút dengue để xác định đám hoại tử tạo ra bởi virút dengue.
2.2.3.2 Mơi trường khơng huyết thanh
- Mơi trường MEM 1X: được pha chế và sản xuất theo tiêu chuẩn tại VABIOTECH từ MEM (GIBCO) bột.
- Mơi trường LH3E: là mơi trường nuơi cấy virút do VABIOTECH phát triển từ MEM (GIBCO) dạng bột, cĩ bổ sung thêm glucose và các chất vi lượng phù hợp cho sự phát triển của virút sau gây nhiễm trên tế bào.
2.2.3.3 Mơi trường thử vơ khuẩn
- Mơi trường Thio: mơi trường tối ưu để kiểm tra sự cĩ mặt của vi khuẩn.
- Mơi trường Soybean: mơi trường tối ưu để kiểm tra sự cĩ mặt của nấm.
2.1.4 Các hĩa chất và sinh phẩm
- Dung dịch PBS cho nuơi cấy tế bào và cho tinh chế virút. - Dung dịch M199 dùng cho tinh chế virút
- Dung dịch Trypsin 0,25% (w/v), TrypLE 1X (GIBCO) để tách tế bào. - Kháng thể đơn dịng kháng các týp huyết thanh virút dengue (NIH) - Kháng thể cộng hợp dê kháng chuột gắn Peroxidase (KPL)
- Dung dịch True Blue (KPL) - Enzyme Benzonase (MERCK) - Dung dịch MgCl2
2.1.5 Dụng cụ và trang thiết bị
Dụng cụ nuơi cấy tế bào và gây nhiễm Hãng
- Cốc thủy tinh đựng mơi trường và các dung dịch SCHOTT - Chai nuơi tế bào một lớp, phiến nuơi Tế bào 24 giếng CORNING
- Chai nuơi cấy tế bào cell factory CORNING
- Pipet, đầu cơn COSTA
- Phiến pha lỗng mẫu 96 giếng đáy U CORNING
- Màng siêu lọc 300 kDa và 100 kDa MILLIPORE
- Cốc lọc 0.22 µm MILLIPORE
- Cột lọc 0.5/0.22 µm MILLIPORE
Dụng cụ bảo vệ, khử trùng và thực hiện thí nghiệm
- Đèn cồn, bơng cồn, găng tay, quần áo vơ trùng, panh, gạc lau
VIỆT NAM
Trang thiết bị thực hiện
- Tủ lạnh, tủ âm sâu, bình đựng nitơ SANYO
- Máy lắc sinh học TAITEC
- Tủ an tồn sinh học HÀN QUỐC
- Pipet aid, pipetman EPPENDORF
- Kính hiển vi lộn ngược OLYMPUS
- Buồng đếm tế bào NEUBAUER
2.2 Phương pháp
2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số lượng tế bào Vero trên chai nuơi một lớp hoặc chai Cell factory lượng tế bào Vero trên chai nuơi một lớp hoặc chai Cell factory
Nguyên tắc
Tế bào Vero được cất giữ trong mơi trường cĩ huyết thanh và chất bảo quản DMSO, chất bảo quản này giúp cho tế bào khơng bị chết khi cất giữ ở nhiệt âm sâu (nitơ lỏng -196 °C), nhưng đồng thời cũng là chất cĩ thể gây độc tế bào khi chuyển lại điều kiện nuơi cấy bình thường. Các ống tế bào sẽ được đơng tan nhanh trong nước ấm (37oC) và chuyển vào trong mơi trường nuơi cấy, mơi trường với DMSO tồn dư được loại bỏ sau 1 ngày. Tế bào sau khi nhân lên phủ kín bề mặt chai sẽ được tách chuyển tiếp sang các chai nuơi mới.
Các bước tiến hành
a. Cấy chuyển tế bào từ điều kiện bảo quản ra chai nuơi cấy một lớp
- Hút chuyển 24 ml mơi trường MEM 10 % FBS vào chai nuơi tế bào 75 cm2, làm ấm mơi trường bằng bể ổn nhiệt tại 37 oC, 10 phút.
- Lấy ống tế bào Vero bảo quản trong N2 lỏng, cho nhanh vào cốc nước 37 oC. - Khi hỗn dịch trong ống tế bào tan hồn tồn, hút tồn bộ hỗn dịch, từ từ chuyển vào trong chai nuơi tế bào cĩ mơi trường đã được làm ấm. (Thực hiện trong tủ an tồn sinh học)
- Lắc nhẹ chai cho tế bào lan đều bề mặt, chuyển vào tủ ấm 37oC.
- Sau 24 giờ, kiểm tra mức độ bám của tế bào Vero trên bề mặt chai, hút bỏ tồn bộ mơi trường cũ (cĩ chứa DMSO), chuyển 25ml mơi trường MEM 10%FBS đã làm ấm vào các chai.
- Tiếp tục nuơi và theo tế bào tại 37oC từ 3-5 ngày.
b. Cấy chuyển, nhân thêm tế bào trên chai nuơi cấy một lớp
- Kiểm tra chai tế bào (nuơi từ 2-3 ngày) trước khi tiến hành: mơi trường nuơi cấy trong suốt, màu đỏ cam, tế bào phủ kín 90-100% bề mặt (hình 2.1). - Ủ ấm mơi trường MEM 10% FBS, Trypsin và PBS trong 37oC từ 15 đến 30
phút.
- Hút sạch tồn bộ nước nổi trong các chai tế bào.
- Chuyển 10 ml PBS vào trong chai tế bào (75 cm2). Tráng rửa bề mặt rồi hút bỏ tồn bộ PBS.
- Lặp lại bước trên thêm 1 lần.
- Chuyển 1 ml dung dịch Trypsin 0.25% vào trong chai tế bào (75 cm2), láng đều bề mặt.
- Ủ các chai trong 37oC từ 3-5 phút, soi kính hiển vi kiểm tra tế bào tách khỏi bề mặt chai.
- Vỗ nhẹ vào thành chai cho tế bào tách hồn tồn.
- Chuyển 9 ml mơi trường MEM 10% FBS vào chai tế bào để trung hịa trypsin. - Lấy mẫu hỗn dịch tế bào để đếm bằng buồng đếm tế bào. Tính mật độ tế bào
trong hỗn dịch tế bào thu được.
- Chuyển tế bào trong hỗn dịch thu được vào mỗi chai nuơi cấy một lớp mới hoặc chai Cell Factory với mật độ tế bào từ 2,5 – 3,5x 104 tế bào/ cm2.
- Thêm mơi trường MEM 10% FBS vừa đủ với tỉ lệ thể tích 0,33 ml/ cm2 vào mỗi chai.
- Chuyển các chai nuơi cấy tế bào mới vào tủ ấm 37oC, theo dõi từ 2-3 ngày.
Hình 2.1. Tế bào Vero sau khi nuơi cấy.
A: Sau 1 ngày, B: sau 2 ngày, C: Sau 3 ngày.
2.2.2 Phương pháp gây nhiễm và nuơi cấy virút dengue trên tế bào
Nguyên tắc
Để đảm bảo cho virút nhân lên hiệu quả trong tế bào, quá trình gây nhiễm sẽ được tiến hành khi tế bào đang ở pha sinh trưởng, phủ kín 90% đến 95% bề mặt chai. Khảo sát liều gây nhiễm và mơi trường phù hợp để đạt hiệu giá virút sau nuơi cấy tốt nhất.
Các bước tiến hành
- Làm ấm mơi trường khơng huyết thanh, PBS ở 37oC.
- Kiểm tra mức độ phủ kín của tế bào Vero trên bề mặt chai (từ 85% đến 95%). - Tách 2-3 chai tế bào để đếm và tính số lượng tế bào trong mỗi chai (xem phương
pháp cấy chuyển tế bào) từ đĩ tính lượng tế bào cĩ trong chai CF10. Tính lượng virút dengue cần để gây nhiễm theo cơng thức dưới đây:
Trong đĩ: X là thể tích hỗn dịch virút cần gây nhiễm cho một chai tế bào (ml). A là tổng số tế bào trong một chai tế bào trên chai cần gây nhiễm. B là hiệu giá của chủng sản xuất trong 1ml (PFU/ml)
MOI là liều gây nhiễm tính theo số virút gây nhiễm cho 100 tế bào
- Pha lỗng X (ml) virút dengue tính ở trên trong 400 ml mơi trường khơng huyết thanh cho mỗi chai Cell Factory 10 tầng (CF10), tương đương 40 ml/ tầng (1 tầng chai CF10 CORNING cĩ diện tích 636 cm2). Ví dụ: với liều gây nhiễm MOI = 0,01, 1,2x109 tế bào/chai CF10, hiệu giá virút 106 PFU/ml thì thể tích virút (X) cần cho mỗi chai sẽ là 12 ml.
- Tráng rửa mỗi chai tế bào CF10 bằng 800 ml mơi trường khơng huyết thanh. - Bổ sung 400 ml hỗn dịch virút sau pha lỗng vào mỗi chai.
X =
AxMOI B
- Láng đều bề mặt, ủ các chai 37oC trong khoảng 1 – 2 giờ. Lắc đều chai nuơi cấy sau mỗi 15 phút ủ.
- Bổ sung vào mỗi chai 1600 ml mơi trường khơng huyết thanh. - Ủ nuơi các chai trong tủ ấm 37 0.5oC; 5 0.5% CO2 từ 5-8 ngày.
2.2.3 Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm
Nguyên tắc
Virút dengue sau khi gây nhiễm và nuơi cấy sẽ được thu hoạch vào ngày đạt hiệu giá cao nhất. Hỗn dịch virút sau thu hoạch sẽ được bổ sung chất ổn định và tiến hành các bước tinh chế vắc xin, hoặc được bảo quản ở nhiệt độ - 70oC.
Các bước tiến hành
- Kiểm tra các chai tế bào sau gây nhiễm bằng cảm quan và kính hiển vi: nước nổi tế bào trong, màu đỏ cam, tế bào cĩ bị thay đổi nhiều về hình thái hoặc rụng nhiều hay khơng.
- Bơm chuyển hoặc đổ tồn bộ nước nổi vào chai đựng.
- Chuyển vào mỗi chai 10% dung dịch SPG 10X, hộn đều hỗn dịch.
- Hỗn dịch nước nổi sẽ được chuyển sang các bước tinh chế tiếp theo, hoặc bảo quản ở nhiệt độ -70oC.
2.2.4 Phương pháp ly tâm
Nguyên tắc:
Ly tâm là phương pháp tách nhanh chĩng các phân tử cĩ khối lượng riêng khác nhau, thường tách pha lỏng và pha rắn khi nồng độ pha rắn lớn nhờ lực ly tâm. Hỗn