Hàm lượng DNA (ƞg/ml) hiệu giá virút (lgPFU/ml)
DEN 1 Đầu vào 400 7.01
1 giờ 0.1 7
24 giờ 0.04 6.82
DEN 2 Đầu vào 200 6.8
1 giờ 0.5 6.8
24 giờ 0.3 6.7
DEN 3 Đầu vào 400 6.71
1 giờ 0.5 6.7
24 giờ 0.3 6.5
DEN 4 Đầu vào 320 7.32
1 giờ 1.6 7.11
24 giờ 1.6 7
Từ kết quả kiểm tra hàm lượng DNA tồn dư (bảng 10) cho thấy: enzyme benzonase cho hiệu quả cắt DNA tốt ở nồng độ enzyme xử lý 10 U/ml. Sau 1 giờ ở nhiệt độ phịng hiệu quả cắt đạt từ 99,5 – 99,975% và đạt từ 99,5% - 99,99% sau 24 giờ ở nhiệt độ 4 – 8 oC. Kết quả này tương đồng với những báo cáo về qui trình tinh chế vắc xin sởi nuơi cấy trên tế bào Vero do Kirsten K. Langfield và cộng sự thiết lập năm 2011 đã tiến hành xử lý DNA tế bào chủ với enzyme benzonase ở nồng độ 10 U/ml và ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ, sau đĩ chuyển hỗn dịch vào nhiệt độ 4 - 8 oC trong ít nhất 24 giờ [34]. Theo nghiên cứu của Si-Ming Li và cộng sự đã tiến hành xử lý hỗn dịch virút dại nuơi cấy trên tế bào vero sau cơ đặc với enzyme benzonase nồng độ 10 U/ml ở nhiệt độ 4 – 8 oC trong 24 giờ. Kết quả sau xử lý cho thấy DNA tế bào Vero sau xử lý đã giảm xuống dưới 0,1 ng/ml [56].
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra DNA tồn dư trước và sau xử lý enzyme mẫu rDEN 1
Từ kết quả kiểm tra hiệu giá virút dengue (Bảng 3.3) cho thấy hiệu giá virút dengue giảm khơng đáng kể khi xử lý enzyme trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Tuy nhiên hiệu giá virút giảm từ 0,2 – 0,3 log PFU/ml trong quá trình xử lý enzyme ở nhiệt độ 4 – 8 oC trong 24 giờ. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây của nhĩm, hiệu giá virút dengue sẽ giảm theo thời gian khi bảo quản ở dạng lỏng. Ngồi ra hàm lượng DNA trong hỗn dịch sau khi xử lý sau 1 giờ ở nhiệt độ phịng từ 0,1 – 1,6 ng/ml đạt yêu cầu để sử dụng trong bán thành phẩm vắc xin. Do vậy chúng tơi lựa chọn chỉ xử lý enzyme ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ nhằm đảm bảo duy trì hiệu giá virút cũng như rút ngắn thời gian chung của qui trình sản xuất.
3.2.3 Qui trình thẩm tích hỗn dịch
Hỗn dịch virút sau khi xử lý enzyme sẽ được thẩm tích sử dụng màng siêu lọc nhằm loại bỏ các thành phần protein tế bào chủ, enzyme benzonase và protein cĩ kích thước nhỏ, các acid amin, hoặc thành phần đệm muối vơ cơ dư thừa cĩ trong mơi trường nuơi cấy, và thay thế thành phần đệm phù hợp cho việc bảo quản virút bán thành phẩm, giữ lại các hạt virút nguyên vẹn. Việc lựa chọn chính xác kích thước, diện tích màng siêu lọc, thể tích đệm cần sử dụng đĩng vai trị quan trọng ảnh hưởng tới hiệu quả của việc thẩm tích. Thơng thường lựa chọn kích thước lỗ màng lọc trung bình nhỏ hơn từ 1/5 – 1/3 kích thước sản phẩm mục tiêu cần giữ lại được cho là tối ưu [43].
Nhĩm nghiên cứu đã tiến hành lựa chọn kích thước màng siêu lọc phù hợp để thẩm tích. Hỗn dịch virút sau cắt enzyme sẽ được thử thẩm tích sử dụng màng lọc Millipore Pellicon 2 Mini 0.1 m2 với 2 kích thước lỗ màng 100 kDa và 300 kDa. Đệm
thẩm tích sử dụng đệm M199 + SPG, lượng đệm sử dụng bằng 5 lần thể tích mẫu. Lấy mẫu kiểm tra protein tổng số và hiệu giá virút trước và sau khi thẩm tích.
Kết quả kiểm tra protein tổng số và hiệu giá virút được thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra protein tổng số và hiệu giá virút trước và sau thẩm tích
Mẫu Thời gian tiến hành Protein tổng số (μg/ml) Hiệu giá virút Hiệu giá virút trong nước thải DEN 1 Trước thẩm tích 60.95 6.82 Màng 100 kDA 3.5 31.55 6.1 Khơng xác định được Màng 300 kDA 2 28.51 6.28 DEN 2 Trước thẩm tích 66.56 7.15 Màng 100 kDA 3 30.17 6.4 Khơng xác định được Màng 300 kDA 2 22.34 6.45 DEN 3 Trước thẩm tích 81.12 6.7 Màng 100 kDA 3 27.12 5.7 Khơng xác định được Màng 300 kDA 2.5 26.67 6.02 DEN 4 Trước thẩm tích 56.64 7.32 Màng 100 kDA 3.5 22.74 6.63 Khơng xác định được Màng 300 kDA 2 13.22 6.82
Hỗn dịch virút sau thẩm tích với 5 lần thể tích đệm, cả 2 loại màng trên đều cho kết quả hỗn dịch trong, cĩ màu vàng nhạt tương đương màu đệm thẩm tích. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu khảo sát hiệu quả phương pháp thẩm tích liên tục của hãng Pall cho thấy với 5 lần thể tích đệm hiệu quả của phương pháp thẩm tích liên tục lên tới 99,3% các loại muối, dung mơi, đệm và 97,6% các phân tử cĩ kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ màng [48].
Hình 3.10. Hệ thống lọc tiếp tuyến sử dụng trong thẩm tích liên tục
Màng thẩm tích 300 kDa do cĩ kích thước lỗ màng lớn hơn nên cho khả năng loại protein tạp kích thước nhỏ tốt hơn và thời gian thẩm tích nhanh hơn (thời gian thẩm tích nhanh hơn từ 1,5 – 2 lần) so với màng 100 kDa. Hiệu giá virút mất đi trong q trình thẩm tích đối với màng 100 kDa là từ 100,69 – 101 Log PFU/ml, đối với màng 300 kDa là từ: 100,5 – 100,7 Log PFU/ml. Chúng tơi đã tiến hành kiểm tra virút trong nước thải thẩm tích cả 04 chủng virút, kết quả khơng phát hiện virút trong nước thải cho thấy cả 2 kích cỡ màng thẩm tích đều khơng để lọt virút ra nước thải. Từ những kết quả này cho thấy màng thẩm tích Pellicon 2, 300 kDa phù hợp hơn cho quy trình sản xuất vắc xin. Do đĩ màng thầm tích này sẽ được lựa chọn trong qui trình sản xuất.
3.2.4 Quy trình lọc vơ trùng hỗn dịch virút
Bán thành phẩm trước khi bảo quản sẽ được lọc vơ trùng nhằm loại bỏ nguy cơ tạp nhiễm vi khuẩn hoặc nấm trong quá trình tinh chế vắc xin. Do hỗn dịch virút dengue sau tinh chế đã tinh khiết nên kích thước màng lọc cần sử dụng khơng cần quá lớn. Tuy nhiên, màng lọc được lựa chọn phải đảm bảo tiêu chuẩn về lọc vơ trùng, khơng bám dính protein, và khơng làm mất hiệu giá virút trước và sau lọc. Ngồi ra, màng lọc phải được thiết kế cĩ thể kiểm tra độ tồn vẹn của màng trước và sau lọc để thuận lợi cho việc thẩm định qui trình sản xuất sau này. Trong nghiên cứu này,
chúng tơi lựa chọn màng lọc Millipak 20, 0.22 μm, diện tích màng lọc 100 cm2, chất liệu màng khơng bám dính protein (PVDF). Mẫu bán thành phẩm sau lọc được kiểm tra thử nghiệm vơ khuẩn và hiệu giá virút. Kết quả kiểm tra được thể hiện dưới bảng sau: