Tên mẫu Hiệu giá virút (log PFU/ml) Thử nghiệm vơ khuẩn Trước lọc Sau lọc
DEN 1 6.28 6.28 Đạt
DEN 2 6.45 6.4 Đạt
DEN 3 6.02 6.02 Đạt
DEN 4 6.82 6.75 Đạt
Từ kết quả kiểm tra chất lượng mẫu bán thành phẩm trước và sau lọc (Bảng 3.5) cho thấy: bán thành phẩm cả 4 chủng virút dengue sau lọc đều đạt yêu cầu về thử nghiệm vơ khuẩn, nấm. Hiệu giá virút được duy trì ổn định trong quá trình lọc. Màng lọc trước và sau khi lọc đều được kiểm tra và đạt yêu cầu của thử nghiệm độ tồn vẹn của màng lọc [41]. Từ những kết quả này, nhĩm nghiên cứu quyết định lựa chọn màng lọc Millipak 20 0.22 μm trong qui trình lọc vơ khuẩn bán thành phẩm vắc xin. Mẫu bán thành phẩm sau lọc sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -80 oC.
Hình 3.11. Phiến chuẩn độ hiệu giá rDEN 1 các bước sản xuất
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Mẫu thu hoạch
Mẫu sau xử lý enzyme
Mẫu sau thẩm tích
Mẫu sau lọc cuối
3.2.5. Qui trình tinh chế virút dengue ở quy mơ phịng thí nghiệm
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tơi đưa ra qui trình tinh chế virút vắc xin dengue như sau:
Đối với vắc xin dengue phát triển tại Việt Nam, VABIOTECH hướng tới vắc xin dạng đơng khơ, tứ giá được phối trộn theo cơng thức TV005 với các thành phần rDEN 1, rDEN 3, rDEN 4 cĩ hiệu giá trên 103 PFU/ liều tiêm, rDEN 2 cĩ hiệu giá trên 104 PFU/ liều tiêm. Do đĩ một trong những tiêu chuẩn của các bán thành phẩm đơn giá là hiệu giá virút phải cao hơn 105 PFU/ml đối với các chủng rDEN 1; rDEN 3; rDEN 4 và cao hơn 106 PFU/ml đối với chủng rDEN 2 để thuận lợi cho việc phối
Lọc bán thành phẩm và bảo quản
Sử dụng màng Millipak 20 0.22 μm. Và bảo quản -80oC
Thẩm tích hỗn dịch
Màng Pellicon 2 300 kDa, 0.1 m2. Thẩm tích liên tục với 5 lần thể tích đệm M199 + SPG
Xử lý enzyme benzonase
Nồng độ 10 IU/ml, thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phịng
Tinh sạch loại xác tế bào
Cột lọc Millipore XL600, 0.5/0.2 μm
trộn cũng như đảm bảo hiệu giá mất đi trong quá trình đơng khơ vẫn đạt yêu cầu về hiệu giá trong thành phần vắc xin. Tương tự như vậy, đối với thành phần DNA tế bào chủ tồn dư để đạt yêu cầu hàm lượng DNA tế bào chủ thấp hơn 10 ng/ liều tiêm, thì thành phần DNA tồn dư trong các bán thành phẩm đơn giá phải thấp hơn 25 ng/ml.
Khác với thành phần DNA tồn dư, TCYTG khơng cĩ những khuyến cáo cụ thể về hàm lượng protein tế bào chủ tồn dư trong thành phần vắc xin thành phẩm. Do sự đa dạng của các dịng tế bào chủ cũng như mức độ phức tạp trong việc phát triển phương pháp ELISA nhằm xác định chính xác hàm lượng protein tế bào chủ. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm sinh học được chấp thuận bởi FDA cĩ chứa hàm lượng protein tế bào chủ trong giới hạn 1 – 100 ppm [32]. Đối với tế bào Vero, trên thị trường hiện nay đã cĩ kit thương mại xác định hàm lượng protein tế bào chủ, tuy nhiên trong khuơn khổ nội dung của đề tài chúng tơi chỉ tiến hành kiểm tra hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Lowery nhằm khảo sát hiệu quả loại protein trong quá trình tinh chế. Phương pháp này khơng xác định được hàm lượng protein tế bào Vero tồn dư trong thành phần bán thành phẩm. Việc đánh giá chất lượng bán thành phẩm vắc xin chuyên sâu hơn bao gồm các test kiểm tra protein tế bào Vero tồn dư, hàm lượng enzyme benzonase tồn dư sẽ được tiến hành trong các nghiên cứu tiếp theo. Thành phần protein tế bào chủ tồn dư trong vắc xin được cho là cĩ tiềm năng gây ra các phản ứng phụ, các dị ứng khơng mong muốn, do đĩ tính an tồn của vắc xin sẽ được tiếp tục xem xét ở các thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật, và lâm sàng trên người.
Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu bán thành phẩm trước và sau tinh chế và các tiêu chuẩn cơ sở được tổng hợp dưới bảng sau: