Chủng virút
Mẻ gặt
Hiệu giá virút (Log PFU/ml) Thử nghiệm vơ khuẩn
Kết luận
Tiêu chuẩn cơ sở Kết quả
rDEN 1 H1 6.0 7.42 Đạt Đạt H2 6.0 7.12 Đạt Đạt H3 6.0 6.65 Đạt Đạt rDEN 2 H1 6.0 7.24 Đạt Đạt H2 6.0 7.15 Đạt Đạt H3 6.0 6.73 Đạt Đạt rDEN 3 H1 6.0 6.65 Đạt Đạt H2 6.0 6.70 Đạt Đạt H3 6.0 6.31 Đạt Đạt rDEN 4 H1 6.0 8.09 Đạt Đạt H2 6.0 8.12 Đạt Đạt
Đối với qui trình sản xuất trên đây, qui mơ cĩ thể mở rộng bằng cách tăng số lượng tầng trên chai nuơi, hoặc tăng số lượng chai nhiều tầng để đảm bảo lượng virút cần thiết theo yêu cầu trong 1 loạt sản xuất mà khơng cần phải thay đổi nền tảng nuơi cấy tế bào hoặc thay đổi qui trình sản xuất.
3.2 Xây dựng qui trình tinh chế virút ở quy mơ phịng thí nghiệm
Theo yêu cầu của các cơ quan quản lý, các nhà sản xuất thuốc và dược phẩm sinh học nĩi chung phải kiểm sốt tối đa các sản phẩm, đảm bảo được chất lượng và các tiêu chuẩn kĩ thuật. Các nhà sản xuất phải đảm bảo các sản phẩm của họ khơng tạp nhiễm các chất như axit nucleic, các virut ngoại lại, nội độc tố và các protein tế bào chủ. Do đĩ, việc tinh sạch, tinh chế các sản phẩm sinh học trong quá trình sản xuất cần phải được kiểm sốt, kiểm định chặt chẽ. Đối với các loại vắc xin sản xuất trên cơng nghệ nuơi cấy dịng tế bào thường trực nĩi chung và tế bào Vero nĩi riêng cĩ nhiều ưu điểm như: virút thường phát triển tốt cho hiệu giá cao, chủ động kiểm sốt tính đồng nhất, chất lượng của tế bào, dễ dàng nâng qui mơ sản xuất và giá thành rẻ hơn so với sản xuất vắc xin trên phơi gà hay sử dụng những dịng tế bào lưỡng bội và tế bào tiên phát. Tuy nhiên qui trình sản xuất sử dụng dịng tế bào này cĩ các nguy cơ như tồn dư lượng lớn DNA, protein tế bào chủ, hoặc huyết thanh động vật trong mơi trường. Trong qui trình sản xuất, mơi trường nuơi cấy virút khơng bổ sung huyết thanh, do vậy trong qui trình tinh chế chỉ tập trung loại trừ thành phần tồn dư từ tế bào chủ như DNA và protein. Ngồi ra, với vắc xin sống giảm độc lực, việc giữ cho virút ổn định, giảm thiểu thất thốt hiệu giá virút trong nhiều cơng đoạn của quá trình sản xuát tinh chế cũng là một thách thức đối với nhĩm nghiên cứu.
3.2.1 Qui trình tinh sạch hỗn dịch virút
Trong quá trình nuơi cấy virút nĩi chung, nhiều tế bào bị hủy hoại và trơi nổi trong hỗn dịch virút. Do vậy, bước đầu tiên trong qui trình tinh chế là tinh sạch loại bỏ các mảnh vỡ tế bào trong hỗn dịch sau thu hoạch và giữ lại các hạt virút nguyên vẹn. Một trong các phương pháp thường được các nhà sản xuất vắc xin áp dụng đĩ là kết hợp giữa ly tâm tốc độ thấp và lọc. Ly tâm tốc độ thấp giúp loại trừ được các mảnh xác tế bào lớn, đối với các mảng xác tế bào nhỏ cần sử dụng màng siêu lọc để loại trừ. Phương pháp thứ hai là bước ly tâm loại bỏ xác tế bào được thay thế bằng màng tiền lọc cĩ kích thước lỗ lọc lớn. Việc sử dụng màng tiền lọc thay vì ly tâm cĩ thể giúp nâng quy mơ sản xuất dễ dàng hơn. Ngồi ra, hiện nay với sự phát triển cơng nghệ của các loại màng lọc, hiệu quả lọc trên cùng một diện tích màng lọc đã tăng lên đáng kể nhờ việc thiết kế các loại vật liệu, và cấu trúc màng lọc mới. Một trong
những thuận lợi cho qui trình tinh chế vắc xin dengue là các chủng virút dengue tái tổ hợp thường tạo nhiễm trùng kéo dài, và ít gây hủy hoại tế bào. Lượng xác tế bào trong hỗn dịch virút thu hoạch cũng khơng quá lớn, nên việc sử dụng màng tiền lọc với kích thước lớn để loại bỏ xác tế bào là hồn tồn khả thi. Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành so sánh đối chứng giữa phương pháp kết hợp giữa ly tâm tốc độ thấp kết hợp với sử dụng màng siêu lọc và phương pháp sử dụng cột lọc lớn với nhiều lớp màng kích thước khác nhau được xếp chồng lên nhau để tinh sạch hỗn dịch.
Việc lựa chọn diện tích màng lọc phù hợp đĩng vai trị quan trọng trong việc xây dựng phương pháp. Nếu diện tích màng lọc nhỏ, thời gian lọc lâu và nguy cơ tắc trong quá trình lọc. Nếu diện tích màng lọc lớn, nguy cơ mất mẫu do mẫu bám vào màng lọc, và giá thành cao. Việc lựa chọn diện tích màng lọc phụ thuộc vào thể tích dung dịch cần lọc, và lượng vật chất cĩ trong dung dịch.
Hỗn dịch virút sau thu hoạch sẽ được đơng tan ở nhiệt độ 37 oC và được chia làm 2: khoảng 1000 ml sẽ được ly tâm ở tốc độ 3000 rpm/ 15 phút. Phần nước nổi sẽ được lọc sử dụng màng siêu lọc 0.22 μm, diện tích màng 40 cm2; 1000 ml cịn lại sẽ được lọc trực tiếp sử dụng cột lọc Millipore XL 600 bao gồm 2 lớp 0.5/ 0.2 μm; tổng diện tích màng lọc 590 cm2. Cả 2 loại màng được sử dụng trong thí nghiệm đều sử dụng vật liệu màng là Polyethersulfone (PES). Đặc tính của màng lọc PES là cho khả năng bám protein thấp (thấp hơn so với vật liệu cellulose hoặc nilon), tốc độ dịng chảy cao, và chịu được khả các điều kiện khắc nghiệt. Lấy mẫu sau mỗi bước xử lý và kiểm tra hiệu giá virút bằng phương pháp chuẩn độ miễn dịch. Kết quả kiểm tra hiệu giá virút được tổng hợp theo bảng dưới đây: