1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
2.2 Phương pháp
2.2.10 Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Lowry
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời cĩ độ hấp thụ cực đại ở bước sĩng 660nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta cĩ thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Các bước tiến hành
- Chuẩn bị mẫu thử: tùy mẫu mà độ pha lỗng khác nhau, sao cho kết quả nằm
trong đường chuẩn. Thơng thường BTP pha lỗng 5 lần, BTPCC và VX ko pha lỗng. - Dùng pipet hút 1ml các dung dịch albumin chuẩn 50; 100; 150 µg/ml vào các
ống nghiệm 2, 3, 4.
- Mẫu thử là BTP: dùng pipet hút 1ml mẫu vào ống nghiệm số 5.
- Mẫu thử là BTPCC, thành phẩm: dùng pipet hút 4ml mẫu thử vào ống nghiệm số 6.
- Thêm 1ml dung dịch TCA 10% vào mỗi ống nghiệm 2, 3, 4.
- Mẫu thử là BTP: thêm 1ml dung dịch TCA 10% vào ống nghiệm số 5, lắc đều. - Mẫu thử là BTPCC, thành phẩm: thêm 0,4ml dung dịch TCA 50% vào ống
nghiệm số 6, lắc đều.
- Đun cách thủy 1000C trong 15 phút, làm nguội trong nước 5 phút. Bao kín miệng các ống nghiệm bằng giấy parafilm.
- Ly tâm 3500 v/p trong 20 phút ở nhiệt độ phịng, dùng pipetman hút bỏ nước nổi (chú ý thay đầu cơn đối với mỗi mẫu và chuẩn, làm thật nhẹ nhàng tránh bong cặn).
- Thêm 2ml TCA 5% vào mỗi ống nghiệm, lắc kỹ. Bao kín miệng ống nghiệm bằng giấy parafilm.
- Ly tâm 3500 v/p trong 20 phút ở nhiệt độ phịng, dùng pipetman hút bỏ nước nổi (chú ý thay đầu cơn đối với mỗi mẫu và chuẩn, làm thật nhẹ nhàng tránh bong cặn).
- Để cách thủy 370C trong 2 giờ.
- Thêm 2,5ml dung dịch đồng alkalin vào tủa thu được và ống nghiệm số 1 (ống blank), lắc kỹ.
- Để 30 phút ở nhiệt độ phịng.
- Thêm 2,5ml WFI và 0,5ml thuốc thử Folin 1:1 vào mỗi ống nghiệm, lắc đều. - Đun cách thủy 370C trong 30 phút.
- Để nguội, đo quang phổ bước sĩng 750 nm.
Tính tốn kết quả:
Dựng đường chuẩn trên Excel, phương trình hồi quy tuyến tính: yT = a.xT + b Trong đĩ: yT: hàm lượng protein (µg/ml)
xT: độ hấp thụ quang đo đc tương ứng với từng nồng độ protein a,b: hệ số của phương trình đường chuẩn
Dựa vào phương trình đường chuẩn đã xác định ở trên để tính ra hàm lượng protein cĩ trong mẫu thử. Cơng thức:
- Bán thành phẩm: Y = n.yT
- BTPCC, thành phẩm: Y = yT/4
Trong đĩ: Y: hàm lượng protein cĩ trong mẫu vắc xin (µg/ml) n: độ pha lỗng mẫu
4 : thể tích mẫu thử (ml)