Chú thích:
Mẫu chứng âm: chai tế bào được nuơi cấy kéo dài theo lịch sản xuất, khơng được
gây nhiễm virus, tế bào già theo thời gian và bám thành từng mảng.
Mẫu gây nhiễm DEN 4: hình ảnh tế bào mẻ gặt H1 tế bào nhiều, mọc kín trên bề
mặt chai nuơi. Ở các mẻ gặt tiếp theo, bị virus hủy hoại trong q trình nhân lên trơi nổi trong mơi trường nuơi cấy, do đĩ lượng tế bào mọc trên bề mặt chai thưa dần. Ở mẻ gặt H4 tế lượng tế bào cịn lại ở chai ni cịn lại ít.
3.1.3 Quy trình nhân ni virút dengue ở quy mơ phịng thí nghiệm
Dựa trên kết quả khảo sát liều gây nhiễm, thời gian hấp phụ, thời gian nuơi cấy virút và số lượng các mẻ gặt cần thiết, chúng tơi xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất chủng virút gốc giống cho sản xuất vắc xin dengue như sau:
Hình 3.8. Sơ đồ tĩm tắt quy trình nhân ni virút dengue
Để đảm bảo yêu cầu sử dụng cho sản xuất vắc xin, hỗn dịch nước nổi virút sau thu hoạch phải đảm bảo khơng tạp nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma, mycobacteria hoặc nhiễm chéo các chủng virút dengue khác. Do đĩ tất cả các bước trong quy trình nuơi cấy tế bào, virút đều được tiến hành trong khu vực kiểm sốt (class C) và trong các tủ an tồn sinh học (class A) đảm bảo vơ trùng, được kiểm tra và thẩm định
Thu hoạch các chủng virus dengue
Thu hoạch nước nổi và bổ sung mơi trường LH3E mới và tiếp tục nuơi cấy. Các mẻ gặt sau cách nhau 3 ngày.
Ủ các chai trong tủ ấm
Nhiệt độ 37± 0.5oC; 5 ± 0.5% CO2 trong 7 ngày
Bổ sung mơi trường nuơi cấy khơng huyết thanh
Mơi trường LH3E 0,33ml/cm2
Gây nhiễm virus dengue
Liều gây nhiễm MOI = 0.01; thời gian hấp phụ 1 giờ
thường xuyên bởi phịng quản lý chất lượng. Nước nổi sau thu hoạch của tất cả các mẻ gặt đều được lưu mẫu và tiến hành kiểm tra vơ khuẩn (xem phần 2.2.10). Ngồi ra, dựa trên cơng thức pha dự kiến cho các chủng dengue từ 103 – 104 PFU/ml, và để thuận lợi cho qui trình tinh chế virút sau này, hiệu giá virút của tất cả các chủng, và các mẻ gặt phải đạt trên 106 PFU/ml. Kết quả kiểm tra chất lượng các mẻ gặt của các chủng virút dengue được tổng hợp theo bảng dưới đây:
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng các mẻ gặt đơn virút dengue
Chủng virút
Mẻ gặt
Hiệu giá virút (Log PFU/ml) Thử nghiệm vơ khuẩn
Kết luận
Tiêu chuẩn cơ sở Kết quả
rDEN 1 H1 6.0 7.42 Đạt Đạt H2 6.0 7.12 Đạt Đạt H3 6.0 6.65 Đạt Đạt rDEN 2 H1 6.0 7.24 Đạt Đạt H2 6.0 7.15 Đạt Đạt H3 6.0 6.73 Đạt Đạt rDEN 3 H1 6.0 6.65 Đạt Đạt H2 6.0 6.70 Đạt Đạt H3 6.0 6.31 Đạt Đạt rDEN 4 H1 6.0 8.09 Đạt Đạt H2 6.0 8.12 Đạt Đạt
Đối với qui trình sản xuất trên đây, qui mơ cĩ thể mở rộng bằng cách tăng số lượng tầng trên chai nuơi, hoặc tăng số lượng chai nhiều tầng để đảm bảo lượng virút cần thiết theo yêu cầu trong 1 loạt sản xuất mà khơng cần phải thay đổi nền tảng nuơi cấy tế bào hoặc thay đổi qui trình sản xuất.
3.2 Xây dựng qui trình tinh chế virút ở quy mơ phịng thí nghiệm
Theo yêu cầu của các cơ quan quản lý, các nhà sản xuất thuốc và dược phẩm sinh học nĩi chung phải kiểm sốt tối đa các sản phẩm, đảm bảo được chất lượng và các tiêu chuẩn kĩ thuật. Các nhà sản xuất phải đảm bảo các sản phẩm của họ khơng tạp nhiễm các chất như axit nucleic, các virut ngoại lại, nội độc tố và các protein tế bào chủ. Do đĩ, việc tinh sạch, tinh chế các sản phẩm sinh học trong quá trình sản xuất cần phải được kiểm sốt, kiểm định chặt chẽ. Đối với các loại vắc xin sản xuất trên cơng nghệ ni cấy dịng tế bào thường trực nĩi chung và tế bào Vero nĩi riêng cĩ nhiều ưu điểm như: virút thường phát triển tốt cho hiệu giá cao, chủ động kiểm sốt tính đồng nhất, chất lượng của tế bào, dễ dàng nâng qui mơ sản xuất và giá thành rẻ hơn so với sản xuất vắc xin trên phơi gà hay sử dụng những dịng tế bào lưỡng bội và tế bào tiên phát. Tuy nhiên qui trình sản xuất sử dụng dịng tế bào này cĩ các nguy cơ như tồn dư lượng lớn DNA, protein tế bào chủ, hoặc huyết thanh động vật trong mơi trường. Trong qui trình sản xuất, mơi trường ni cấy virút khơng bổ sung huyết thanh, do vậy trong qui trình tinh chế chỉ tập trung loại trừ thành phần tồn dư từ tế bào chủ như DNA và protein. Ngồi ra, với vắc xin sống giảm độc lực, việc giữ cho virút ổn định, giảm thiểu thất thốt hiệu giá virút trong nhiều cơng đoạn của quá trình sản xuát tinh chế cũng là một thách thức đối với nhĩm nghiên cứu.
3.2.1 Qui trình tinh sạch hỗn dịch virút
Trong q trình ni cấy virút nĩi chung, nhiều tế bào bị hủy hoại và trơi nổi trong hỗn dịch virút. Do vậy, bước đầu tiên trong qui trình tinh chế là tinh sạch loại bỏ các mảnh vỡ tế bào trong hỗn dịch sau thu hoạch và giữ lại các hạt virút nguyên vẹn. Một trong các phương pháp thường được các nhà sản xuất vắc xin áp dụng đĩ là kết hợp giữa ly tâm tốc độ thấp và lọc. Ly tâm tốc độ thấp giúp loại trừ được các mảnh xác tế bào lớn, đối với các mảng xác tế bào nhỏ cần sử dụng màng siêu lọc để loại trừ. Phương pháp thứ hai là bước ly tâm loại bỏ xác tế bào được thay thế bằng màng tiền lọc cĩ kích thước lỗ lọc lớn. Việc sử dụng màng tiền lọc thay vì ly tâm cĩ thể giúp nâng quy mơ sản xuất dễ dàng hơn. Ngồi ra, hiện nay với sự phát triển cơng nghệ của các loại màng lọc, hiệu quả lọc trên cùng một diện tích màng lọc đã tăng lên đáng kể nhờ việc thiết kế các loại vật liệu, và cấu trúc màng lọc mới. Một trong
những thuận lợi cho qui trình tinh chế vắc xin dengue là các chủng virút dengue tái tổ hợp thường tạo nhiễm trùng kéo dài, và ít gây hủy hoại tế bào. Lượng xác tế bào trong hỗn dịch virút thu hoạch cũng khơng quá lớn, nên việc sử dụng màng tiền lọc với kích thước lớn để loại bỏ xác tế bào là hồn tồn khả thi. Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành so sánh đối chứng giữa phương pháp kết hợp giữa ly tâm tốc độ thấp kết hợp với sử dụng màng siêu lọc và phương pháp sử dụng cột lọc lớn với nhiều lớp màng kích thước khác nhau được xếp chồng lên nhau để tinh sạch hỗn dịch.
Việc lựa chọn diện tích màng lọc phù hợp đĩng vai trị quan trọng trong việc xây dựng phương pháp. Nếu diện tích màng lọc nhỏ, thời gian lọc lâu và nguy cơ tắc trong q trình lọc. Nếu diện tích màng lọc lớn, nguy cơ mất mẫu do mẫu bám vào màng lọc, và giá thành cao. Việc lựa chọn diện tích màng lọc phụ thuộc vào thể tích dung dịch cần lọc, và lượng vật chất cĩ trong dung dịch.
Hỗn dịch virút sau thu hoạch sẽ được đơng tan ở nhiệt độ 37 oC và được chia làm 2: khoảng 1000 ml sẽ được ly tâm ở tốc độ 3000 rpm/ 15 phút. Phần nước nổi sẽ được lọc sử dụng màng siêu lọc 0.22 μm, diện tích màng 40 cm2; 1000 ml cịn lại sẽ được lọc trực tiếp sử dụng cột lọc Millipore XL 600 bao gồm 2 lớp 0.5/ 0.2 μm; tổng diện tích màng lọc 590 cm2. Cả 2 loại màng được sử dụng trong thí nghiệm đều sử dụng vật liệu màng là Polyethersulfone (PES). Đặc tính của màng lọc PES là cho khả năng bám protein thấp (thấp hơn so với vật liệu cellulose hoặc nilon), tốc độ dịng chảy cao, và chịu được khả các điều kiện khắc nghiệt. Lấy mẫu sau mỗi bước xử lý và kiểm tra hiệu giá virút bằng phương pháp chuẩn độ miễn dịch. Kết quả kiểm tra hiệu giá virút được tổng hợp theo bảng dưới đây:
Bảng 3.2. Hiệu giá virút sau tinh sạch
Loạt 01 Loạt 02 Loạt 03 Hiệu giá trung bình (log PFU/ml) SD DEN 1 Mẻ gặt đơn H1 7.02 7.11 6.8 6.98 Ly tâm 7.0 6.9 6.8 6.90 0.10 Lọc 6.8 6.9 6.72 6.81 0.16 Lọc cột 6.9 7.01 6.70 6.87 0.18 DEN 2 Mẻ gặt đơn H1 7.0 6.8 7.23 7.01 0.22 Ly tâm 7.0 6.8 7.2 7.00 0.20 Lọc 6.80 6.7 7.0 6.83 0.15 Lọc cột 6.90 6.8 7.15 6.95 0.18 DEN 3 Mẻ gặt đơn H1 6.62 6.81 6.52 6.65 0.15 Ly tâm 6.6 6.8 6.45 6.62 0.18 Lọc 6.57 6.78 6.45 6.60 0.17 Lọc cột 6.6 6.71 6.4 6.57 0.16 DEN 4 Mẻ gặt đơn H1 7.80 7.50 7.50 7.60 0.17 Ly tâm 7.52 7.40 7.3 7.41 0.11 Lọc 7.50 7.40 7.3 7.42 0.08 Lọc cột 7.30 7.32 7.27 7.30 0.03
Từ kết quả tổng hợp theo bảng 9 cho thấy: hiệu giá virút mất đi sau quá trình ly tâm và lọc giảm từ 100,05± 0,02 – 100,29 ± 0,11 PFU/ml. Trong đĩ hiệu giá virút rDEN 3 giảm ít nhất, virút rDEN 4 giảm nhiều nhất do hiệu giá rDEN 4 trước lọc cao hơn rất nhiều so với rDEN 3. Hiệu giá virút mất đi sau quá trình tinh sạch của cả 2 phương pháp khác biệt khơng đáng kể, do vậy hồn tồn cĩ thể áp dụng một trong 2 phương
pháp này vào quá trình tinh sạch virút. Tuy nhiên, việc tiến hành phương pháp ly tâm phức tạp và tốn thời gian hơn phương pháp lọc, qui trình tiến hành bao gồm nhiều bước, thao tác khĩ hơn cho người vận hành, dễ nhiễm khuẩn chéo trong quá trình thao tác so với phương pháp lọc cột. Ngồi ra, việc nâng qui mơ đối với phương pháp ly tâm là khĩ khăn hơn rất nhiều, do cần nhiều thiết bị ly tâm hoặc phải tiến hành nhiều mẻ ly tâm. Sử dụng lọc cột giúp dễ dàng nâng quy mơ sau này thơng qua việc tăng kích thước cột và ghép các cột lọc song song. Do vậy nhĩm nghiên cứu quyết định chọn sử dụng cột lọc Millipore XL 600 cho qui trình tinh sạch vắc xin.
3.2.2 Qui trình xử lý loại DNA tế bào bằng enzyme
Các dịng tế bào tiên phát và tế bào lưỡng bội đã được sử dụng thành cơng để sản xuất nhiều loại vắc xin virút, và thành phần DNA tồn dư từ các dịng tế bào này trong vắc xin được cho là an tồn và khơng cĩ các nguy cơ rủi ro đáng kể. Tuy nhiên, việc sử dụng các dịng tế bào thường trực cĩ khả năng sinh trưởng liên tục, khơng giới hạn thì thành phần DNA tồn dư từ tế bào này được cho là cĩ thể trao đổi khả năng phát triển khơng kiểm sốt gây ung thư với một số tế bào ở người nhận vắc xin. Nguy cơ lây nhiễm và gây đột biến thơng qua việc trao đổi nhiễm sắc thể, hoặc chèn đoạn vào hệ gen tế bào chủ nhận gây ung thư đã được ghi nhận thử nghiệm in vitro và một vài trường hợp thí nghiệm thực tế trên chuột. Do đĩ, TCYTTG đã cĩ những khuyến cáo cụ thể về các tiêu chuẩn hàm lượng DNA tế bào chủ tồn dư trong thành phầm vắc xin: hàm lượng DNA tế bào chủ tồn dư khơng vượt quá 10 ng/ liều tiêm đối với vắc xin tiêm, và 100 ng/ liều đối với vắc xin uống [66].
Cĩ 3 yếu tố cĩ thể được cân nhắc sử dụng trong qui trình sản xuất liên quan tới DNA tế bào chủ tồn dư bao gồm: (1) Các bước trong qui trình tinh chế làm giảm lượng DNA tồn dư trong qui trình sản xuất; (2) Những tác động làm giảm kích thước của DNA tồn dư trong qui trình sản xuất; (3) bất kì tác động tác động hĩa học nào làm bất hoạt hoạt tính sinh học của DNA tồn dư trong qui trình sản xuất. Dựa vào dạng vắc xin, và đặc tính kháng nguyên cần thu hồi của vắc xin cĩ thể tiến hành kết hợp các phương pháp để loại trừ DNA tồn dư như: đối với vắc xin là dạng polysaccharide cộng hợp cĩ thể sử dụng acid hoặc base, vắc xin bất hoạt cĩ thể sử
dụng beta-propiolactone, vắc xin tiểu phần cĩ thể sử dụng phương pháp chạy cột, siêu ly tâm, enzyme hoặc sử dụng màng lọc tiếp tuyến…
Hiện nay, sử dụng enzyme để xử lý DNA tồn dư được đánh giá cĩ hiệu quả cao và dễ dàng nâng qui mơ. Enzyme benzonase đã được sử dụng thành cơng ở nhiều qui trình sản xuất vắc xin như vắc xin dại, cúm, HPV, sởi và viêm gan A trên tế bào [56, 34]. Enzyme benzonase là sản phẩm protein tái tổ hợp được biểu hiện trên vi khuẩn Serratia Marcescens. Về đặc tính, benzonase là enzyme endonuclease cĩ khả năng cắt cả DNA và RNA chuỗi đơn, chuỗi kép, dạng thẳng, dạng vịng và dạng siêu xoắn bằng cách phân hủy cầu nối phosphodiester giữa các nucleotide. Các DNA và RNA sau khi xử lý bằng benzonase sẽ bị cắt nhỏ thành các oligonucleotide nhỏ, cĩ kích thước 3 – 8 bases. Về cấu tạo, enzyme bezonase là protein gồm cĩ 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần cĩ trọng lượng phân tử khoảng 30 kD. Protein cĩ điểm đẳng điện (pI) ở pH 6.85. Enzyme cĩ thể hoạt động ở dải pH rộng (pH từ 6 – 10), nhiệt độ từ 0 oC – 42oC và enzyme chỉ hoạt động khi cĩ mặt ion Mg2+ nồng độ 1 – 2 mM. Điều kiện tối ưu để enzyme hoạt động là: nồng độ Mg2+ 1 – 2 mM, pH từ 8.0 – 9.2, nhiệt độ 37oC, nồng độ Dithiothreitol (DTT) dưới 100 mM, nồng độ β-mecaptoethanol dưới 100 mM, nồng độ các ion Na+, K+… dưới 20 mM, nồng độ (PO4) 3- dưới 10 mM. Enzyme bị ức chế hồn tồn bởi HCl nồng độ 100 mM và mất trên 90% hoạt tính enzyme bởi EDTA nồng độ 5 mM [42].
Nhĩm nghiên cứu tiến hành khảo sát qui trình xử lý enzyme benzonase như sau: hỗn dịch virút sau tinh sạch được bổ sung dung dịch MgCl2 200 mM đến nồng độ cuối 2 mM trước khi xử lý enzyme benzonase ở nồng độ 10 U/ml, thời gian xử lý là 1 giờ ở nhiệt độ phịng (18 – 25 oC), sau đĩ chuyển mẫu vào 4 – 8oC trong 24 giờ. Lấy mẫu ở thời điểm trước, sau 1 giờ, và sau 24 giờ xử lý enzyme để kiểm tra hàm lượng DNA tồn dư và hiệu giá virút.
Kết quả kiểm tra hàm lượng DNA tồn dư và hiệu giá virút được tổng hợp theo bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra DNA tổng số trước và sau xử lý enzyme
Hàm lượng DNA (ƞg/ml) hiệu giá virút (lgPFU/ml)
DEN 1 Đầu vào 400 7.01
1 giờ 0.1 7
24 giờ 0.04 6.82
DEN 2 Đầu vào 200 6.8
1 giờ 0.5 6.8
24 giờ 0.3 6.7
DEN 3 Đầu vào 400 6.71
1 giờ 0.5 6.7
24 giờ 0.3 6.5
DEN 4 Đầu vào 320 7.32
1 giờ 1.6 7.11
24 giờ 1.6 7
Từ kết quả kiểm tra hàm lượng DNA tồn dư (bảng 10) cho thấy: enzyme benzonase cho hiệu quả cắt DNA tốt ở nồng độ enzyme xử lý 10 U/ml. Sau 1 giờ ở nhiệt độ phịng hiệu quả cắt đạt từ 99,5 – 99,975% và đạt từ 99,5% - 99,99% sau 24 giờ ở nhiệt độ 4 – 8 oC. Kết quả này tương đồng với những báo cáo về qui trình tinh chế vắc xin sởi nuơi cấy trên tế bào Vero do Kirsten K. Langfield và cộng sự thiết lập năm 2011 đã tiến hành xử lý DNA tế bào chủ với enzyme benzonase ở nồng độ 10 U/ml và ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ, sau đĩ chuyển hỗn dịch vào nhiệt độ 4 - 8 oC trong ít nhất 24 giờ [34]. Theo nghiên cứu của Si-Ming Li và cộng sự đã tiến hành xử lý hỗn dịch virút dại nuơi cấy trên tế bào vero sau cơ đặc với enzyme benzonase nồng độ 10 U/ml ở nhiệt độ 4 – 8 oC trong 24 giờ. Kết quả sau xử lý cho thấy DNA tế bào Vero sau xử lý đã giảm xuống dưới 0,1 ng/ml [56].
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra DNA tồn dư trước và sau xử lý enzyme mẫu rDEN 1
Từ kết quả kiểm tra hiệu giá virút dengue (Bảng 3.3) cho thấy hiệu giá virút dengue giảm khơng đáng kể khi xử lý enzyme trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Tuy nhiên hiệu giá virút giảm từ 0,2 – 0,3 log PFU/ml trong quá trình xử lý enzyme ở nhiệt độ 4 – 8 oC trong 24 giờ. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây của