1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
2.2 Phương pháp
2.2.8 Phương pháp chuẩn độ virút dengue bằng tạo đám hoại tử
Nguyên tắc
Virút dengue được pha lỗng với độ pha lỗng 10 lần ở các nồng độ khác nhau và hấp phụ lên tế bào trong phiến nuơi 24 giếng. Các giếng tế bào được bổ sung mơi trường phủ phiến và nuơi tiếp 5 – 6 ngày. Các plaque của virút dengue được phát hiện bằng phương pháp nhuộm miễn dịch.
Các bước tiến hành
a. Pha lỗng mẫu thử
- Dùng pipette đa kênh hút 135 µl mơi trường MEM 1X vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng.
- Chuyển 15 µl mẫu vi rút cần chuẩn độ vào hàng thứ 1 (pha lỗng 1:10).
- Sử dụng pipet đa kênh hộn lên và xuống 20 lần và chuyển 15 µl hỗn dịch từ hàng 1 sang hàng 2.
- Tiến hành tương tự như trên cho tới hàng 6 (độ pha lỗng từ 10-1 đến 10-6). b. Gây nhiễm trên phiến 24 giếng
- Kiểm tra phiến 24 giếng nuơi tế bào Vero (3-4 ngày), tế bào phủ kín khoảng 90- 95%.
- Tráng rửa mỗi giếng tế bào 2 lần bằng 1ml MEM 1X.
- Chuyển 100 µl vi rút pha lỗng vào mỗi giếng theo nồng độ tương ứng.
- Lắc đều và ủ phiến vào tủ ấm 37oC trong 1 giờ. Lắc nhẹ nhàng phiến sau 30 phút để đảm bảo tế bào khơng bị khơ.
c. Phủ phiến và ủ phiến
- Sau thời gian hấp phụ, thêm vào mỗi giếng 1 ml mơi trường phủ 37 oC: MEM + 2% FBS + 1% methylcellulose. Khơng loại bỏ hỗn dịch vi rút trong các giếng trước khi thêm mỗi trường phủ.
- Lắc nhẹ nhàng các phiến và ủ tại tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 5 - 6 ngày. d. Cố định tế bào
- Hút bỏ tồn bộ mơi trường trong mỗi giếng trên phiến sau 5 - 6 ngày nuơi ủ. Tráng rửa mỗi giếng 1 ml PBS + 10 % formandehit, 2 lần.
- Thêm 0,5 ml methanol 80 % vào mỗi giếng, ủ nhiệt độ phịng trong 10 phút. e. Nhuộm phiến
- Bỏ tồn bộ methanol dư thừa.
- Thêm 1 ml dung dịch PBS + 5% skim milk vào mỗi giếng. Ủ tại nhiệt độ phịng 10 phút.
- Đổ bỏ dung dịch trong phiến vào cốc đựng.
- Pha lỗng kháng thể kháng virút dengue trong dung dịch pha lỗng (PBS+5% skim milk)
- Thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch đã pha lỗng kháng thể kháng týp huyết thanh dengue tương ứng. Ủ phiến trong máy lắc ở nhiệt độ 37oC, lắc 60 vịng/ phút, trong 60 phút.
- Đổ bỏ dung dịch kháng thể vào cốc đựng.
- Rửa mỗi giếng 2 lần bằng 1 ml dung dịch PBS + 5 % Skim milk.
- Thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch kháng thể IgG dê kháng chuột cộng hợp peroxidase (pha lỗng 1:2000 trong dung dịch PBS + 5 % Skim milk). Ủ phiến trong máy lắc ở nhiệt độ 37oC, 60 vịng/ phút, trong 60 phút.
- Đổ bỏ dung dịch kháng thể vào cốc đựng.
- Rửa mỗi giếng 2 lần bằng 1 ml dung dịch PBS, loạt bỏ hết dung dịch rửa. - Đặt phiến tại nơi thống giĩ, để phiến khơ tự nhiên trong khoảng 5 phút.
- Thêm vào mỗi giếng 160 µl dung dịch TrueBlue substrate. Lắc nhẹ phiến và giữ tại nhiệt độ phịng tới khi các plaque hiện màu (khoảng 5 – 15 phút). Đếm số lượng plaques trong các giếng. Ghi số lượng plague vào phiếu đọc kết quả.