Nguồn: Beard (1998) - Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn
lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, goi là hiện tượng “ nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân lên tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với cùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phòng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (Murphy and Webster, 1996).
2.4.5. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm
Trong thực tế người ta chia virus cúm ra làm 2 loại: Loại virus độc lực thấp – LPAI và loại có độc lực cao - HPAI.
- LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ khơng có triệu chứng lâm sàng điển hình và khơng làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây nhiễm rộng rãi và tạo nên các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trêm cùng một tế bào và trở thành một lọai virus HPAL nguy hiểm.
- HPAL là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48-72h sau nhiễm. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào xơ phơi gà, tế bào thận chó (MDCK) khơng có trypsin. Các vị dịch lớn đều do virus HPAI gây ra, thường là virus có kháng nguyên H5 và H7.
Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mơ đường hơ hấp và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của động vật cảm nhiễm, do đó cịn được gọi là virus hướng đa phủ tạng. Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus( De Wit, 2008).
2.4.6. Triệu chứng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh diễn biến rất đa dạng và phức tạp, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độc lực, số lượng virus, loài nhiễm bệnh, mật độ chăn ni, tiểu khí hậu chuồng ni, chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm virus …(Nguyễn Tiến Dũng, 2004).
Triệu chứng điển hình là gia cầm chết đột ngột, chết nhiều với tỷ lệ chết từ 20-100%. Con vật sốt cao, ủ rũ, bỏ ăn uống, giảm đẻ, suy yếu và đứng tụm lại thành từng đám, lông xù, xơ xác, chảy nước mũi, dịch mũi nhày màu xám, khó thở, vươn cổ để thở, thở khò khè, hắt hơi, chảy nước mắt, viêm kết mạc mắt,
nhắm mắt, sưng phù đầu, mào tích sưng phù, màu tím sẫm. Con vật có triệu chứng thần kinh như co giật, mất thăng bằng, vận động xoay tròn.
2.4.7. Bệnh tích
2.4.7.1. Bệnh tích đại thể
Bệnh tích thường gặp là mào, tích sưng to, tím tái phù quanh mí mắt. Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẽ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ. Xuất huyết điểm trên bề mặt niên mạc và tương mạc nội tạng. Xuất huyết hầu hết tồn bộ đường tiêu hóa, đặc biệt thấy rõ ở manh tràng và dạ dày tuyến. Túi Fabricius xung huyết và xuất huyết (Lê Văn Năm, 2004; Alexander, 2007).
2.4.7.2. Bệnh tích vi thể
Bệnh tích vi thể chủ yếu là xung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân ở não và một số cơ quan khác. Mạch quản của cơ quan như mào, gan, lách, phổi, thận, cơ tim, cơ vân, não... bị giãn rộng và thâm nhiễm tế bào (Beard, 1998). 2.4.8. Chẩn đoán bệnh
2.4.8.1. Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học
Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ học như bệnh lây lan nhanh, gia cầm mọi lứa tuổi, nhiều loại gia cầm mắc bệnh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% số gia cầm mắc bệnh, những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phòng vacxin cúm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phòng nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt mức thấp.
2.4.8.2. Chẩn đốn dựa vào triệu chứng và bệnh tích
Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đốn. Lưu ý các đặc điểm chính như gia cầm bệnh chảy nhiều nước mắt, viên xoang mũi, mào tích tím tái, phù đầu và mí mắt, có triệu chứng thần kinh, da chân vùng không lông xuất huyết.
Căn cứ những bệnh tích điển hình như phổi, gan, thận, lách sưng to. Xuất huyết mỡ vành tim, ruột viêm cata, xuất huyết. Xuất huyết dạ dày cơ, dạ dày tuyến giống bệnh Newcastle. Túi fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất huyết … (Alexander, 2007; Baigent and Mc Cauley, 2001).
2.4.8.3. Chẩn đốn phịng thí nghiệm
Chẩn đốn virus học: ni cấy, phân lập virus trên rứng gà có phơi ấp 9 – 10 ngày tuổi hoặc trên môi trường tế bào xơ phôi gà hoặc tế bào thận chó
MDCK. Giám định virus trong dịch ni cấy bằng các phản ứng HA, HI. Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR: cho phép xác định virus với lượng rất nhỏ. Khẳng định chắc chắn subtype H5 và N1, N6 căn cứ vào primer và probe được thiết kế đặc hiệu.
Chẩn đoán huyết thanh học: dùng phản ứng HI để phát hiện và xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia cầm chưa tiêm phịng.
Ngồi ra có thể dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể.
2.5. SƠ LƯỢC HOẠT ĐỘNG GIÁM SÁT CÚM GIA CẦM TẠI VIỆT NAM 2.5.1. Kết quả giám sát 2.5.1. Kết quả giám sát
Kể từ khi xuất hiện tại nước ta, dịch cúm gia cầm đã ảnh hưởng rất nhiều tới nước ta kể về kinh tế, chính trị, văn hóa và xã hội. Chính vì vậy việc chủ động các biện pháp phịng bệnh ln được Đảng và Nhà nước quan tâm. Bên cạnh đó, chúng ta cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các tổ chức trên thế giới như FAO, VAHIP, CDC, USAID, ... qua rất nhiều chương trình giám sát chủ động nhằm phát hiện sự lưu hành của các chủng virus trong cả nước qua đó điều chỉnh các biện pháp phịng chống dịch cho phù hợp. Sơ lược kết quả hoạt động giám sát cúm gia cầm tại nước ta giai đoạn 2008 – 2016 như sau:
- Đối với hoạt động giám sát chủ động cúm gia cầm H5N1: Qua các dự án và ở các giai đoạn khác nhau tại nước ta đều phát hiện có sự lưu hành của virus cúm gia cầm A/H5N1với tỷ lệ khá cao. Cụ thể trong tổng số 48.349 mẫu xét nghiệm đã phát hiện 1.782 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm gia cầm A/H5N1 (3,69%) trong đó ở dự án VAHIP trong tổng số 22.745 mẫu bệnh phẩm có 680 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2,99%); Ở dự án do FAO tài trợ có 1.102/25.604 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (4,3%). Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lẫy 3.840 mẫu bệnh phẩm tại các chợ bn bán gia cầm sống kết quả có 34/3.084 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (1,10%) (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm A/H7N9 trên đàn gia cầm nhập lậu và tại các chợ buôn bán gia cầm sống: Từ tháng 6/2013 đến tháng 2/2015 đã xét nghiệm 171.250 mẫu bệnh phẩm tại các tỉnh Biên giới phía Bắc nước ta (Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và các điểm trung chuyển, chợ buôn bán gia cầm lớn tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang. Kết quả
chưa phát hiện mẫu bệnh phẩm nào dương tính với virus cúm A/H7N9. Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lấy 3.084 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buôn bán gia cầm sống kết quả vẫn chưa phát hiện sự có mặt của virus cúm A/H7N9 trên lãnh thổ Việt Nam (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm gia cầm A/H5N6: từ 12/2015 đến tháng 2/2016 đã triển khai chương trình giám sát lưu hành virus cúm gia cầm H5N6 tại 68 chợ buôn bán gia cầm ở 60 huyện, 32 tỉnh trong cả nước. Tổng số mẫu bệnh phẩm thu thập là 3.084 mẫu (mẫu gộp). Kết quả xét nghiệm cho thấy có 108/3.084 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 (3,50%) (Phạm Thành Long, 2016).
2.5.2. Kết quả phân tích virus cúm gia cầm tại Việt Nam
Để làm tốt cơng tác phịng, chống bệnh cúm gia cầm độc lực cao, ngoài việc xác định tỷ lệ lưu hành tại các địa phương trong cả nước thì cơng tác nghiên cứu, giải trình tự gen của virus để qua đó lựa chọn loại vaccine phù hợp cho công tác tiêm phịng trong cả nước.
Bảng 2.3. Tóm tắt các chủng virus cúm gia cầm tại Việt Nam từ 2003 - 2016
Năm Miền Bắc Miền Nam
2003 - 2005 Virus H5N1 xâm nhập vào Việt Nam Clade 1 2007 - 2008 Xuất hiện Clade 2.3.4 thay thế clade 1;
Clade 7 được phát hiện trên gà nhập lậu
Clade 1 phổ biến và có
những biến đổi.
Clade 2.3.2/2.3.4 thỉnh thoảng được phát hiện. 2009 Phát hiện được nhiều nhánh của clade
2.3.4
2010 Xuất hiện clade 2.3.2 giống với chủng phát hiện tại Mông Cổ, Hong Kong. 2011 -2013 Biến đổi từ clade 2.3.4 sang 2.3.2.1 với
3 nhánh phụ A, B, C
2014 Clade 2.3.2.1C là chủ yếu
Xuất hiện virusH5N6 (Clade 2.3.4.4)
Clade 2.3.2.1C phổ
biến
Clade 1.1 có tại một
vài ổ dịch
2015 - 2016 H5N6 Clade 2.3.4.4 lưu hành chủ yếu H5N1 Clade 2.3.2.1C
phổ biến
Kể từ khi dịch cúm gia cầm xuất hiện tại nước ta tới nay, virus cúm luôn luôn thay đổi về cấu trúc tạo ra các chủng virus mới có độc lực cao gây nhiều khó khăn cho cơng tác phịng chống dịch tại các địa phương. Quá trình biến đổi của các chủng virus cúm tại Việt Nam từ 2003 đến nay được thể hiện qua bảng 2.3. 2.6. CƠNG TÁC PHỊNG, CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM
Tại nước ta hiện nay, bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao là 1 trong 5 bệnh ưu tiên phối hợp liên ngành giữa y tế và thú y trong việc điều tra, giám sát, chia sẻ thông tin và nghiên cứu khoa học theo Thông tư 16/2013/TTLT-BYT- BNNPTNT. Đối với công tác xử lý các ổ dịch cúm gia cầm thực hiện theo Thông
tư 07/2016/TT-BNNPTNT ngày 31/5/2016 của Bộ Nông nghiệp và PTNT quy định về phòng, chống dịch bệnh động vật trên cạn.
Đối với dịch cúm A/H7N9 thực hiện theo Quyết định số 210/QĐ-BNN- TY ngày 14/02/2014 của Bộ Nông nghiệp và PTNT về việc Ban hành Kế hoạch hành động ứng phó khẩn cấp với các chủng virus cúm nguy hiểm có khả năng lây lan sang người.
Trong điều kiện chăn nuôi gia cầm như ở Việt Nam hiện nay, để kiểm soát dịch cúm gia cầm, một biện pháp rất quan trọng là tạo miễn dịch chủ động bằng cách tiêm vacxin cho đàn gia cầm. Theo kết quả nghiên cứu mới nhất, hiện nay tại nước ta lưu hành 2 chủng virus cúm gia cầm chủ yếu là virus cúm A/H5N1 thuộc nhánh 2.3.2.1C và virus cúm A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4 (Cục Thú y , 2016). Do đó các loại vaccine được sử dụng cho cơng tác tiêm phịng hiện nay là: - Vacxin cúm gia cầm H5N1 Navet-Vifluvac sử dụng để phòng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1, A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C và A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
- Vacxin cúm H5N1 Re-6 sử dụng để phòng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C gây ra.
- Vacxin H5N1 Re-5 có thể phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1 và virus cúm A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
Bên cạnh đó cần tăng cường hoạt động giám sát chủ động đặc biệt là tại các tỉnh vùng biên giới, các chợ buôn bán, các điểm thu gom gia cầm sống để phát hiện thêm các chủng virus mới cũng như xác định sự lưu hành của virus tại các địa phương qua đó đưa ra các cảnh báo sớm, các khuyến cáo kịp thời trong
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Virus cúm A/H5N6 trong các mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và vịt; mẫu môi trường (mẫu phân tươi, mẫu nước thải, mẫu nước uống, mẫu chất thải trên lông nhốt gia cầm) tại 08 chợ buôn bán gia cầm sống ở 2 tỉnh: Lạng Sơn (các chợ Đồng Đăng, Thất Khê, Hội Hoan và Na Dương) và Quảng Ninh (các chợ Minh Thành, Rừng, Địa Chất và Cái Răm).
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Tình hình chăn ni và dịch bệnh cúm gia cầm tại các tỉnh từ năm 2013 đến 3 tháng đầu năm2017 2013 đến 3 tháng đầu năm2017
3.2.2. Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ
- Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu bệnh phẩm. - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu bệnh phẩm. - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu bệnh phẩm. - Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vòng lấy mẫu. - Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu.
3.2.3. Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên HA của một số chủng dương tính cúm A/H5N6 số chủng dương tính cúm A/H5N6
- Phân tích, so sánh sự tương đồng về nucleotide và aminoacid của gen HA với chủng tham chiếu
- Xác định chuỗi nối giữa HA1 và HA2
- Xác định mối quan hệ phả hệ của chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu và các chủng đăng ký trong ngân hàng gen.
3.3. NGUYÊN LIỆU 3.3.1. Mẫu thí nghiệm 3.3.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu dịch ngốy hầu họng của gà, vịt và mẫu môi trường tại 08 chợ đã được lựa chọn.
3.3.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất lấy mẫu
3.3.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Máy PCR- Axygen
- Máy ly tâm lạnh ZK306, máy ly tâm lạnh Hettick - Máy votex, spin
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp II –ESCO - Buồng cấy an toàn sinh học cấp I
- Máy triết tách mẫu tự động TACO - Hệ thống điện di BIO-RAD - Lị vi sóng, tủ lạnh -20oC, -80oC
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf có thể tích khác nhau.
-Bảo hộ lao động, tăm bông vô trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu,
nhãn dán mẫu, phiếu ghi thông tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, găng tay,...
3.3.2.2. Hóa chất
- Mơi trường bảo quản mẫu: Môi trường PBS – Glycerol, được pha theo công thức sau:
+ Pha hỗn hợp PBS và Glycerol theo tỷ lệ 1:1
+ Bổ sung kháng sinh vào 1l môi trường PBS/Glycerol - Benzylpenicillin: 2*106IU/l
- Streptomycine: 200mg/l - Gentamycine: 250mg/l
Kiểm tra PH khoảng 7,4, chuyển 3ml vào ống 15ml, bảo quản 40C - Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT
- Bộ kít dùng cho phản ứng realtime RT-PCR: SuperScriptIII One step qRT-PCR (Cat No.11732-020)
- Bộ kít dùng cho phản ứng RT-PCR: SuperScriptIII One step RT-PCR (Cat No. 12574-026)
- Cồn Ethanol tuyệt đối-Merk -Thạch Agar (Invitrogen) - Marker, Gelred, Loading dye - TBE10X, TBE1X.
- Nước cất khử ion
- Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H5N6 - Đoạn mồi (primers) và Đoạn dị (probe) để phát hiện virus, - Đoạn mồi dùng để giải trình tự gen HA
Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi và đoạn dò để phát hiện virus H5N6 và giải trình tự gen HA Tên mồi Kí hiệu mồi/probe Trình tự (5'-3') M-4 (CDC) Probe FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1
Mồi xuôi GACCRATCCTGTCACCTCTGAC Mồi ngược AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA
H5-9S
Mồi xuôi ACATATGACTACCCACARTATTCAG
Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1 Mồi ngược 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC
Mồi ngược 2 AAACCAGCCACTATGATTGC
N6-1
Mồi xuôi CCCCACCAATGGGAACTG
Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1
Mồi ngược TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC
HA1 S17H5F1 TGTAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGGTYTAAT
S18_H5R CAGGAAACAGCTATGACCCATACCAACCATCTAYCATTC HA2 S19_H5F751 TGTAAAACGACGGCCAGTAYGCMTAYAARATTGTCAAG
S19_H5R1773 CAGGAAACAGCTATGACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACAAT
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích
Áp dụng cho điều tra tình hình chăn ni gia cầm, tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh trong giai đoạn từ năm 2013 đến hết năm 2016 (Nguyễn Như