Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.5. Sơ lược hoạt động giám sát cúm gia cầm tại việt nam
2.5.1. Kết quả giám sát
Kể từ khi xuất hiện tại nước ta, dịch cúm gia cầm đã ảnh hưởng rất nhiều tới nước ta kể về kinh tế, chính trị, văn hóa và xã hội. Chính vì vậy việc chủ động các biện pháp phịng bệnh ln được Đảng và Nhà nước quan tâm. Bên cạnh đó, chúng ta cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các tổ chức trên thế giới như FAO, VAHIP, CDC, USAID, ... qua rất nhiều chương trình giám sát chủ động nhằm phát hiện sự lưu hành của các chủng virus trong cả nước qua đó điều chỉnh các biện pháp phòng chống dịch cho phù hợp. Sơ lược kết quả hoạt động giám sát cúm gia cầm tại nước ta giai đoạn 2008 – 2016 như sau:
- Đối với hoạt động giám sát chủ động cúm gia cầm H5N1: Qua các dự án và ở các giai đoạn khác nhau tại nước ta đều phát hiện có sự lưu hành của virus cúm gia cầm A/H5N1với tỷ lệ khá cao. Cụ thể trong tổng số 48.349 mẫu xét nghiệm đã phát hiện 1.782 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm gia cầm A/H5N1 (3,69%) trong đó ở dự án VAHIP trong tổng số 22.745 mẫu bệnh phẩm có 680 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2,99%); Ở dự án do FAO tài trợ có 1.102/25.604 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (4,3%). Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lẫy 3.840 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buôn bán gia cầm sống kết quả có 34/3.084 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (1,10%) (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm A/H7N9 trên đàn gia cầm nhập lậu và tại các chợ buôn bán gia cầm sống: Từ tháng 6/2013 đến tháng 2/2015 đã xét nghiệm 171.250 mẫu bệnh phẩm tại các tỉnh Biên giới phía Bắc nước ta (Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và các điểm trung chuyển, chợ buôn bán gia cầm lớn tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang. Kết quả
chưa phát hiện mẫu bệnh phẩm nào dương tính với virus cúm A/H7N9. Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lấy 3.084 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buôn bán gia cầm sống kết quả vẫn chưa phát hiện sự có mặt của virus cúm A/H7N9 trên lãnh thổ Việt Nam (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm gia cầm A/H5N6: từ 12/2015 đến tháng 2/2016 đã triển khai chương trình giám sát lưu hành virus cúm gia cầm H5N6 tại 68 chợ buôn bán gia cầm ở 60 huyện, 32 tỉnh trong cả nước. Tổng số mẫu bệnh phẩm thu thập là 3.084 mẫu (mẫu gộp). Kết quả xét nghiệm cho thấy có 108/3.084 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 (3,50%) (Phạm Thành Long, 2016).
2.5.2. Kết quả phân tích virus cúm gia cầm tại Việt Nam
Để làm tốt cơng tác phịng, chống bệnh cúm gia cầm độc lực cao, ngoài việc xác định tỷ lệ lưu hành tại các địa phương trong cả nước thì cơng tác nghiên cứu, giải trình tự gen của virus để qua đó lựa chọn loại vaccine phù hợp cho cơng tác tiêm phịng trong cả nước.
Bảng 2.3. Tóm tắt các chủng virus cúm gia cầm tại Việt Nam từ 2003 - 2016
Năm Miền Bắc Miền Nam
2003 - 2005 Virus H5N1 xâm nhập vào Việt Nam Clade 1 2007 - 2008 Xuất hiện Clade 2.3.4 thay thế clade 1;
Clade 7 được phát hiện trên gà nhập lậu
Clade 1 phổ biến và có
những biến đổi.
Clade 2.3.2/2.3.4 thỉnh thoảng được phát hiện. 2009 Phát hiện được nhiều nhánh của clade
2.3.4
2010 Xuất hiện clade 2.3.2 giống với chủng phát hiện tại Mông Cổ, Hong Kong. 2011 -2013 Biến đổi từ clade 2.3.4 sang 2.3.2.1 với
3 nhánh phụ A, B, C
2014 Clade 2.3.2.1C là chủ yếu
Xuất hiện virusH5N6 (Clade 2.3.4.4)
Clade 2.3.2.1C phổ
biến
Clade 1.1 có tại một
vài ổ dịch
2015 - 2016 H5N6 Clade 2.3.4.4 lưu hành chủ yếu H5N1 Clade 2.3.2.1C
phổ biến
Kể từ khi dịch cúm gia cầm xuất hiện tại nước ta tới nay, virus cúm luôn luôn thay đổi về cấu trúc tạo ra các chủng virus mới có độc lực cao gây nhiều khó khăn cho cơng tác phịng chống dịch tại các địa phương. Quá trình biến đổi của các chủng virus cúm tại Việt Nam từ 2003 đến nay được thể hiện qua bảng 2.3. 2.6. CÔNG TÁC PHÒNG, CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM
Tại nước ta hiện nay, bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao là 1 trong 5 bệnh ưu tiên phối hợp liên ngành giữa y tế và thú y trong việc điều tra, giám sát, chia sẻ thông tin và nghiên cứu khoa học theo Thông tư 16/2013/TTLT-BYT- BNNPTNT. Đối với công tác xử lý các ổ dịch cúm gia cầm thực hiện theo Thông
tư 07/2016/TT-BNNPTNT ngày 31/5/2016 của Bộ Nông nghiệp và PTNT quy định về phòng, chống dịch bệnh động vật trên cạn.
Đối với dịch cúm A/H7N9 thực hiện theo Quyết định số 210/QĐ-BNN- TY ngày 14/02/2014 của Bộ Nông nghiệp và PTNT về việc Ban hành Kế hoạch hành động ứng phó khẩn cấp với các chủng virus cúm nguy hiểm có khả năng lây lan sang người.
Trong điều kiện chăn nuôi gia cầm như ở Việt Nam hiện nay, để kiểm soát dịch cúm gia cầm, một biện pháp rất quan trọng là tạo miễn dịch chủ động bằng cách tiêm vacxin cho đàn gia cầm. Theo kết quả nghiên cứu mới nhất, hiện nay tại nước ta lưu hành 2 chủng virus cúm gia cầm chủ yếu là virus cúm A/H5N1 thuộc nhánh 2.3.2.1C và virus cúm A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4 (Cục Thú y , 2016). Do đó các loại vaccine được sử dụng cho cơng tác tiêm phịng hiện nay là: - Vacxin cúm gia cầm H5N1 Navet-Vifluvac sử dụng để phòng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1, A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C và A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
- Vacxin cúm H5N1 Re-6 sử dụng để phòng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C gây ra.
- Vacxin H5N1 Re-5 có thể phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1 và virus cúm A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
Bên cạnh đó cần tăng cường hoạt động giám sát chủ động đặc biệt là tại các tỉnh vùng biên giới, các chợ buôn bán, các điểm thu gom gia cầm sống để phát hiện thêm các chủng virus mới cũng như xác định sự lưu hành của virus tại các địa phương qua đó đưa ra các cảnh báo sớm, các khuyến cáo kịp thời trong
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Virus cúm A/H5N6 trong các mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và vịt; mẫu môi trường (mẫu phân tươi, mẫu nước thải, mẫu nước uống, mẫu chất thải trên lông nhốt gia cầm) tại 08 chợ buôn bán gia cầm sống ở 2 tỉnh: Lạng Sơn (các chợ Đồng Đăng, Thất Khê, Hội Hoan và Na Dương) và Quảng Ninh (các chợ Minh Thành, Rừng, Địa Chất và Cái Răm).
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Tình hình chăn ni và dịch bệnh cúm gia cầm tại các tỉnh từ năm 2013 đến 3 tháng đầu năm2017 2013 đến 3 tháng đầu năm2017
3.2.2. Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ
- Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu bệnh phẩm. - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu bệnh phẩm. - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu bệnh phẩm. - Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vòng lấy mẫu. - Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu.
3.2.3. Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng ngun HA của một số chủng dương tính cúm A/H5N6 số chủng dương tính cúm A/H5N6
- Phân tích, so sánh sự tương đồng về nucleotide và aminoacid của gen HA với chủng tham chiếu
- Xác định chuỗi nối giữa HA1 và HA2
- Xác định mối quan hệ phả hệ của chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu và các chủng đăng ký trong ngân hàng gen.
3.3. NGUYÊN LIỆU 3.3.1. Mẫu thí nghiệm 3.3.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu dịch ngốy hầu họng của gà, vịt và mẫu môi trường tại 08 chợ đã được lựa chọn.
3.3.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất lấy mẫu
3.3.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Máy PCR- Axygen
- Máy ly tâm lạnh ZK306, máy ly tâm lạnh Hettick - Máy votex, spin
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp II –ESCO - Buồng cấy an toàn sinh học cấp I
- Máy triết tách mẫu tự động TACO - Hệ thống điện di BIO-RAD - Lị vi sóng, tủ lạnh -20oC, -80oC
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf có thể tích khác nhau.
-Bảo hộ lao động, tăm bông vô trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu,
nhãn dán mẫu, phiếu ghi thông tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, găng tay,...
3.3.2.2. Hóa chất
- Mơi trường bảo quản mẫu: Mơi trường PBS – Glycerol, được pha theo công thức sau:
+ Pha hỗn hợp PBS và Glycerol theo tỷ lệ 1:1
+ Bổ sung kháng sinh vào 1l môi trường PBS/Glycerol - Benzylpenicillin: 2*106IU/l
- Streptomycine: 200mg/l - Gentamycine: 250mg/l
Kiểm tra PH khoảng 7,4, chuyển 3ml vào ống 15ml, bảo quản 40C - Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT
- Bộ kít dùng cho phản ứng realtime RT-PCR: SuperScriptIII One step qRT-PCR (Cat No.11732-020)
- Bộ kít dùng cho phản ứng RT-PCR: SuperScriptIII One step RT-PCR (Cat No. 12574-026)
- Cồn Ethanol tuyệt đối-Merk -Thạch Agar (Invitrogen) - Marker, Gelred, Loading dye - TBE10X, TBE1X.
- Nước cất khử ion
- Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H5N6 - Đoạn mồi (primers) và Đoạn dò (probe) để phát hiện virus, - Đoạn mồi dùng để giải trình tự gen HA
Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi và đoạn dò để phát hiện virus H5N6 và giải trình tự gen HA Tên mồi Kí hiệu mồi/probe Trình tự (5'-3') M-4 (CDC) Probe FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1
Mồi xuôi GACCRATCCTGTCACCTCTGAC Mồi ngược AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA
H5-9S
Mồi xuôi ACATATGACTACCCACARTATTCAG
Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1 Mồi ngược 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC
Mồi ngược 2 AAACCAGCCACTATGATTGC
N6-1
Mồi xuôi CCCCACCAATGGGAACTG
Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1
Mồi ngược TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC
HA1 S17H5F1 TGTAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGGTYTAAT
S18_H5R CAGGAAACAGCTATGACCCATACCAACCATCTAYCATTC HA2 S19_H5F751 TGTAAAACGACGGCCAGTAYGCMTAYAARATTGTCAAG
S19_H5R1773 CAGGAAACAGCTATGACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACAAT
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích
Áp dụng cho điều tra tình hình chăn ni gia cầm, tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh trong giai đoạn từ năm 2013 đến hết năm 2016 (Nguyễn Như Thanh, 2001).
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
3.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu dịch ngốy hầu họng
Dùng tăm bơng vơ trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà, vịt ngoáy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc, tại mỗi chợ, mỗi lần lấy 30 mẫu dịch ngoáy hầu
họng của gà và 30 mẫudịch ngoáy hầu họng của vịt sau đó cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch bảo quản. Gộp 05 mẫu đơn thành 01 mẫu xét nghiệm, gộp ngay tại chợ đưa vào thùng bảo quản lạnh ở 40C rồi vận chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 48 giờ kể từ khi lấy mẫu.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu môi trường
Dùng tăm bông vô trùng lấy phân gia cầm, chất thải trên lồng nhốt gia cầm, mẫu nước thải tại khu buôn bán gia cầm, mẫu nước cho gia cầm uống sau đó cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch bảo quản. Tại mỗi chợ lấy 1 mẫu phân tươi 2 mẫu chất thải, 2 mẫu nước thải, 1 mẫu nước cho gia cầm uống sau đó đưa vào thùng bảo quản lạnh bảo quản ở 40 C và gửi về phịng thí nghiệm trong vịng 48h kể từ khi lấy mẫu.
Trong quá trình lấy mẫu phải đảm bảo đúng kỹ thuật, tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm.
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6 bằng kỹ thuật Realtime RT- PCR được tiến hành theo hướng dẫn của Cục Thú y (quy trình TCCS 16:2016/TYV2-CĐ của Cơ quan Thú y vùng II) theo các bước tóm tắ tsau:
- Xử lý mẫu bệnh phẩm:
- Triết tách RNA tổng số bằng máy tự động TACO - Chuẩn bị Master mix theo tỷ lệ dưới đây:
Hỗn hợp phản ứng
(Kít Invitrogen Superscript 3 qRT-PCR Kit)
Lượng cho 01 phản ứng, µl 2X Reaction buffer 12.5 Mồi xuôi 20 μM 0.5 Mồi ngược 20 μM 0.5 Taqman probe 6 μM 0.5 Enzyme mix 0.5 Nước cất sạch nuclease 5.5 Mẫu RNA 5 Tổng 25
- Tiến hành nhân gen theo chu trình nhiệt sau: 1 chu kỳ [50oC trong 15 phút, 95oC trong 02 phút], sau đó 40 chu kỳ [95oCC trong10 giây, 60oC trong 40 giây] đọc tín hiệu huỳnh quang ở bước annealingextension(60oC trong 40 giây). Chu trình nhiệt được tối ưu hóatheo hướng dẫn sử dụng của bộ kít. (Cat No.11732-020).
Quy trình xét nghiệm mẫu thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.1. Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N6
Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương (được chuẩn độ trước) có giá trị Ct (± 2 Ct, mẫu đối chứng âm tính khơng có giá trị Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu khơng có Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định.
3.4.4. Phương pháp giải trình tự và phân tích gen HA
- Xác định biến đổi di truyền và nhánh virus cúm gia cầm type A/ H5N6 lưu hành bằng kỹ thuật giải trình tự và phân tích trình gene HA.
Để giải trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A/ H5N6, chúng tôi sử dụng hai cặp primer đặc hiệu để thực hiện khuếch đại bằng phương pháp RT-PCR. Cặp mồi thứ nhất S17S18 (bảng 3.1) khuếch đại đoạn gene HA1 có kích thước sản phẩm khuếch đại là 1100 bp và cặp mồi thứ hai S19S20 (bảng 3.1) khuếch đại đoạn gene HA2 có kích thức sản phẩm khuếch đại là 1000 bp. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu theo hướng dẫn của chuyên gia FAO.
- Thành phần của hỗn hợp nguyên liệu (Mastermix) (Invitrogen Superscript III Platinum One step qRT-PCR Kit – Mỹ), thể tích mỗi phản ứng là 25μl bao gồm nước khơng có enzyme phá hủy RNA và DNA: 8.5μl; dung dịch đệm (2x): 12.5μl; mồi xuôi và ngược (20μM): 1μl; Enzyme: 1.0μl. Cho 23 μl hỗn hợp nguyên liệu vào ống tube (0,2 ml),cho tiếp 2 μl mẫu RNA vào ống tube (0,2 ml), đặt ống vào máy Realtime RT-PCR thực hiện chu trình luân nhiệt như sau:
1 chu kỳ [950C trong 10 giây, 550C trong 20 giây, 680C trong 30 giây], 1 chu kỳ [950C trong 10 giây, 570C trong 20 giây, 680C trong 30 giây], sau đó 35 chu kỳ [950C trong 10 giây, 500C trong 20 giây, 680C trong 60 giây]
250C trong 10 giây và dừng
- Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp điện di trên thạch 2%. Sản phẩm khuếch đại của đoạn gene HA1 và HA2 có kích thước 1100bp và 1000bp. Chọn những mẫu có sản phẩm khuếch đại đoạngene HA1 và HA2 đúng kích thước theothiết kế gửi đi Cơng ty Macrogen, Hàn Quốc giảitrình tự gene.
- Sử dụng các chủng tham chiếu A/duck/VN/Lang Son.R2 (14A324/2014)_H5N6_2.3.4.4A để so sánh
- Sau khi có kết quả, xử lý chuỗi nucleotide và so sánh sự tương đồng bằng phần mềm BioEdit 7.2.6.
- Các chuỗi trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A /H5N6 được xử lý và phân tích bằng phần mềm Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 6.0; Tamura et al., 2013). Tiến hành liên kết, so sánh với các chủng tham chiếu từ ngân hàng gene bằng chức năng liên kết (Alignment by ClustalW) và xác định phân nhóm virus cúm gia cầm type A /H5N6 bằng phương pháp kết nối liền kề (Neighbor-Joining method) với hệ số Bootstap 1.000 lần lặp lại.
3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu dịch bệnh được tổng hợp và vẽ bản đồ bằng phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ ArcGIS 9.3.
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS. Excel, phần mềm WinEpiscope 2.0. tính tỷ lệ dương tính xét nghiệm (tỷ lệ nhiễm p ) tính theo cơng thức:
p = x 100 trong đó a là số mẫu dương tính; n là tổng số mẫu xét
nghiệm). Ước tính tỷ lệ nhiễm trong quần thể(P) với độ tin cậy 95% được theo