Phần 2 Tổng quan tài liệu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích
Áp dụng cho điều tra tình hình chăn nuôi gia cầm, tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh trong giai đoạn từ năm 2013 đến hết năm 2016 (Nguyễn Như Thanh, 2001).
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
3.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu dịch ngoáy hầu họng
Dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà, vịt ngoáy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc, tại mỗi chợ, mỗi lần lấy 30 mẫu dịch ngoáy hầu
họng của gà và 30 mẫudịch ngoáy hầu họng của vịt sau đó cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch bảo quản. Gộp 05 mẫu đơn thành 01 mẫu xét nghiệm, gộp ngay tại chợ đưa vào thùng bảo quản lạnh ở 40C rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ kể từ khi lấy mẫu.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu môi trường
Dùng tăm bông vô trùng lấy phân gia cầm, chất thải trên lồng nhốt gia cầm, mẫu nước thải tại khu buôn bán gia cầm, mẫu nước cho gia cầm uống sau đó cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch bảo quản. Tại mỗi chợ lấy 1 mẫu phân tươi 2 mẫu chất thải, 2 mẫu nước thải, 1 mẫu nước cho gia cầm uống sau đó đưa vào thùng bảo quản lạnh bảo quản ở 40 C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 48h kể từ khi lấy mẫu.
Trong quá trình lấy mẫu phải đảm bảo đúng kỹ thuật, tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm.
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6 bằng kỹ thuật Realtime RT- PCR được tiến hành theo hướng dẫn của Cục Thú y (quy trình TCCS 16:2016/TYV2-CĐ của Cơ quan Thú y vùng II) theo các bước tóm tắ tsau:
- Xử lý mẫu bệnh phẩm:
- Triết tách RNA tổng số bằng máy tự động TACO - Chuẩn bị Master mix theo tỷ lệ dưới đây:
Hỗn hợp phản ứng
(Kít Invitrogen Superscript 3 qRT-PCR Kit)
Lượng cho 01 phản ứng, µl 2X Reaction buffer 12.5 Mồi xuôi 20 μM 0.5 Mồi ngược 20 μM 0.5 Taqman probe 6 μM 0.5 Enzyme mix 0.5 Nước cất sạch nuclease 5.5 Mẫu RNA 5 Tổng 25
- Tiến hành nhân gen theo chu trình nhiệt sau: 1 chu kỳ [50oC trong 15 phút, 95oC trong 02 phút], sau đó 40 chu kỳ [95oCC trong10 giây, 60oC trong 40 giây] đọc tín hiệu huỳnh quang ở bước annealingextension(60oC trong 40 giây). Chu trình nhiệt được tối ưu hóatheo hướng dẫn sử dụng của bộ kít. (Cat No.11732-020).
Quy trình xét nghiệm mẫu thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 3.1. Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N6
Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương (được chuẩn độ trước) có giá trị Ct (± 2 Ct, mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu không có Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định.
3.4.4. Phương pháp giải trình tự và phân tích gen HA
- Xác định biến đổi di truyền và nhánh virus cúm gia cầm type A/ H5N6 lưu hành bằng kỹ thuật giải trình tự và phân tích trình gene HA.
Để giải trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A/ H5N6, chúng tôi sử dụng hai cặp primer đặc hiệu để thực hiện khuếch đại bằng phương pháp RT-PCR. Cặp mồi thứ nhất S17S18 (bảng 3.1) khuếch đại đoạn gene HA1 có kích thước sản phẩm khuếch đại là 1100 bp và cặp mồi thứ hai S19S20 (bảng 3.1) khuếch đại đoạn gene HA2 có kích thức sản phẩm khuếch đại là 1000 bp. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu theo hướng dẫn của chuyên gia FAO.
- Thành phần của hỗn hợp nguyên liệu (Mastermix) (Invitrogen Superscript III Platinum One step qRT-PCR Kit – Mỹ), thể tích mỗi phản ứng là 25μl bao gồm nước không có enzyme phá hủy RNA và DNA: 8.5μl; dung dịch đệm (2x): 12.5μl; mồi xuôi và ngược (20μM): 1μl; Enzyme: 1.0μl. Cho 23 μl hỗn hợp nguyên liệu vào ống tube (0,2 ml),cho tiếp 2 μl mẫu RNA vào ống tube (0,2 ml), đặt ống vào máy Realtime RT-PCR thực hiện chu trình luân nhiệt như sau:
1 chu kỳ [950C trong 10 giây, 550C trong 20 giây, 680C trong 30 giây], 1 chu kỳ [950C trong 10 giây, 570C trong 20 giây, 680C trong 30 giây], sau đó 35 chu kỳ [950C trong 10 giây, 500C trong 20 giây, 680C trong 60 giây]
250C trong 10 giây và dừng
- Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp điện di trên thạch 2%. Sản phẩm khuếch đại của đoạn gene HA1 và HA2 có kích thước 1100bp và 1000bp. Chọn những mẫu có sản phẩm khuếch đại đoạngene HA1 và HA2 đúng kích thước theothiết kế gửi đi Công ty Macrogen, Hàn Quốc giảitrình tự gene.
- Sử dụng các chủng tham chiếu A/duck/VN/Lang Son.R2 (14A324/2014)_H5N6_2.3.4.4A để so sánh
- Sau khi có kết quả, xử lý chuỗi nucleotide và so sánh sự tương đồng bằng phần mềm BioEdit 7.2.6.
- Các chuỗi trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A /H5N6 được xử lý và phân tích bằng phần mềm Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 6.0; Tamura et al., 2013). Tiến hành liên kết, so sánh với các chủng tham chiếu từ ngân hàng gene bằng chức năng liên kết (Alignment by ClustalW) và xác định phân nhóm virus cúm gia cầm type A /H5N6 bằng phương pháp kết nối liền kề (Neighbor-Joining method) với hệ số Bootstap 1.000 lần lặp lại.
3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu dịch bệnh được tổng hợp và vẽ bản đồ bằng phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ ArcGIS 9.3.
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS. Excel, phần mềm WinEpiscope 2.0. tính tỷ lệ dương tính xét nghiệm (tỷ lệ nhiễm p ) tính theo công thức:
p = x 100 trong đó a là số mẫu dương tính; n là tổng số mẫu xét nghiệm). Ước tính tỷ lệ nhiễm trong quần thể(P) với độ tin cậy 95% được theo công thức:
P = p ± 1,96 x SE trong đó SE là sai số chuẩn được tính theo công thức: