Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A qua kính hiển vi điện tử, virus có dạng hình khối tròn, hình trứng hoặc dạng khối dài, đường kính khoảng 80 – 120 nm. Virus có vỏ bọc ngoài, phân tử lượng của hạt virus khoảng 250 triệu Da.
Hình 2.4. Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm
Nguồn: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của
virus, bản chất cấu tạo là màng lipit kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 – 14 nm có đường glycoprotein gồm: HA, NA, M1và các dấu ấn khác của virus (Bender et al., 1999; Zhao et al., 2008). Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỷ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là 2 loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy and Webster, 1996; Uiprasertkul et al., 2007).
Hệ gen của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viêt tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành 1 sợi duy nhất bên trong vỏ capsid, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus (Ito et al., 1998; Conenello et al., 2007).
Phân đoạn 1(gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerasa của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus. Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (trên thực tế là 87,103 Da) (Murphy and Webster, 1996). Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 400C, còn ở virus thích nghi trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 370C) (Subbarao et al., 1998).
Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1- tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme promerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy and Webster, 1996). Gần đây, đã có phát hiện thêm 1 protein (PB1-F2) được mã hóa bởi 1 khung đọc mở khác nhau của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) (Tumpey et al., 2002).
Phân đoạn 3(gen PA) kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83000 Da (trên thực tế là 96.103Da). PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus (Luong and Palese, 1992).
Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt cắt của enzyme protease, đây là vùng quyếtđịnh độc lực của virus (Bosch et al., 1981; Gambotto et al., 2008). Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không được oxy hóa) và 77.103 Da (nếu được oxy hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da và HA2 là 29.103 Da) (Keawcharoen et al., 2005; Luong and Palese, 1992).
Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ.
Phân đoạn 6 (gen NA), là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 – 1410 bp) (Lê Thanh Hòa, 2004). Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.103 Daton.
Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước 1027 bp mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của virus. Có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus. Protein M1 là protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình "nảy chồi" của virus. Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử là 11.103 Da, là protein chuyển màng – kênh ion cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus, trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ(Luong and Palese, 1993; Murphy and Webster, 1996; Basler, 2007).
Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen mã của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của virus.
Như vậy, virus cúm A có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi tính kháng
nguyên tạo nên chủng virus cúm A mới (Suarez and Schultz-Cherry, 2000).
Hình 2.5. Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A
Nguồn: Murphy and Webster (1996) 2.4.2. Cấu trúc, chức năng của Protein Hemagglutinin và Neuraminidase
2.4.2.1. Protein HA (Hemagglutinin)
Protein HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A (David et al., 1999) có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus. Gen mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (invitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI – Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16 subtype HA đã được phát hiện (H1 – H16). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender et al., 1999; Wagner et al., 2002). Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ 2 tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981; Wagner et al., 2002).
Trên phân tử HA có 2 vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C. Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc aminoacid từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ virus (David et al, 1999). Sự biến đổi trong gen mã hóa cho gen kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hàng năm.
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002). Vị trí acid amin 226 (aa226) của HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm. Ngoài ra, một số vị trí acid amin khác: Glutamine 222, Glycine 224 cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong and Palese, 1993).
Gen HA bao gồm hai đoạn HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho một dãy các aminoacid là arginine và lysine (- RRRKK-), tạo nên điểm cắt của Protease. Đây là vùng quyết định độc lực hay tính gây bệnh của virus. Phân tử HA1, HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm.
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí các aminoacid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA. Protein HA kích thích cơ thể sản sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus . Vì thế, protein HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích đến của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở
cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vacxin phòng cúm hiện nay (Bosch et al., 1998). Chuỗi Oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng , chuỗi này chứa một số aminoacid mang tính kiềm (basic aminoacid) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type. Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới (David et al, 1999). Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng phân cắt HA càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm A (Wolfgang Garten, 2008).
Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuôc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzyme protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid. Virus cúm A không có gen tổng hợp enzyme protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus. Càng có nhiều điểm cắt protease hoàn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzyme tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện qua trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thê mà mặng nề hơn(Wolfgang Garten, 2008).
2.4.2.2. Protein NA (Neuraminidase)
Protein Neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C3.2.1) là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng subtype NA.Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu . Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Uiprasertkul et al., 2007).
Protein Neuraminidase có 3 chức năng chính:
- Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa các gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ. Và ngăn cản sự tập hợp các hạt virus mới trên màng tế bào. Virus cần phải có NA thì mới có thể xâm nhập được qua lớp màng mucin của biểu mô hô hấp.
- Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào
tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus nhanh hơn (Uiprasertkul et al., 2007). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu.
Virus Cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô hấp. Chức năng của NA liên quan đến khả năng của virus xuyên qua mang nhầy do phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích. Mặt khác, NA có khả năng phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của virus cúmvà viêm phổi kế phát do vi khuẩn (29). Đột biến trong gen NA làm thay đổi những hoạt tính của enzyme này (Cohen et al., 2013).
Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virrus không đặc hiệu hiện nay (Aoki et al., 2007).
Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA. Sự đột biến trượt xóa gen (slippage-mediated deletion) qua các giai đoạn tiến hóa là hiện tượng đột biến đặc biệt được phát hiện ở gen NA, và đã được chứng minh rằng thông qua loại hình đột biến xóa gen này, virus cúm A/H5N1 sẽ tạo nên một subtype N mới có độc lực cao hơn. (Cohen et al, 2013).
Như vậy kháng nguyên HA và NA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế truyền lây sang người.
2.4.2.3. Các phương thức biến đổi kháng nguyên
a. Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus. Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản sao – proof reading” trong quá trình phiên mã
và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thế “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt-xóa) một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus (Lê Thanh Hòa và cs., 2006). Tùy thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm). Tần xuất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác (Wagner et al., 2002).
Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu trúc, thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới (Wasilenko et al., 2008).
b. Hiện tượng glycosyl hóa
Glycosyl hóa (glycosiylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào với amino acid Asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA và NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X = amino acid bất kỳ, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine). Đây là những vị trí đựơc cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích cuả kháng nguyên nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điển hình thành bộ mã của Asparagine tạo tiền đề cho