2.2.3.1. Thu nhận bệnh nhân tại thời điểm bắt đầu điều trị ARV (T1)
Trước khi thu thập số liệu tất cả các nghiên cứu viên đều được tập huấn về mục đích, quy trình nghiên cứu, cách thức thu thập thơng tin. Các nghiên cứu viên đồng thời tiến hành tập huấn cho bác sĩ điều trị, cán bộ tư vấn, dược sĩ cấp phát thuốc tại các PKNT thực hiện nghiên cứu về mục đích và các quy định trong nghiên cứu,quy trình nghiên cứu, quy trình lấy mẫu, xử lý mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu, các biểu mẫu và cách thức thu thập thơng tin vào các phiếu.
Trong ngày đầu tiên thực hiện nghiên cứu, các nghiên cứu viên trực tiếp làm việc với các cán bộ tại PKNT theo sát từng khâu trong quy trình nghiên cứu, từ việc
tư vấn bệnh nhân ban đầu cho đến lúc mẫu máu được lấy và xử lý. Tất cả các vấn đề phát sinh trong lần thu thập đầu tiên đều được các nghiên cứu viên thảo luận và rút kinh nghiệm với toàn bộ nhân viên của PKNT.
Các mẫu thu thập thơng tin được chuyển về nhĩm nghiên cứu. Khi cĩ bất kỳ các thơng tin nào khơng rõ ràng, thì các nghiên cứu viên đều hỏi lại nhân viên PKNT để được làm rõ. Nhĩm nghiên cứu thảo luận với các cán bộ tại phịng khám và quyết định lựa chọn ngày bắt đầu thực hiện nghiên cứu. Các bệnh nhân nhiễm HIV đến đăng ký điều trị tại các PKNT đều được khám, đánh giá giai đoạn lâm sàng và tiến hành các xét nghiệm cần thiết theo quy định thường quy của Bộ Y tế. Các nhân viên y tế tại phịng khám rà sốt tất cả các bệnh nhân chưa điều trị ARV. Các trường hợp đủ tiêu chuẩn điều trị ARV theo quy định của Bộ Y tế được tư vấn và tiến hành điều trị theo quy trình điều trị HIV/AIDS thường quy.
Trong lần tư vấn cuối cùng, các bệnh nhân đủ điều kiện tham gia nghiên cứu được cán bộ tư vấn giới thiệu về mục đích, nội dung nghiên cứu, ý nghĩa của nghiên cứu và tìm hiểu xem bệnh nhân cĩ muốn tham gia nghiên cứu hay khơng. Nếu khơng đồng ý tham gia, bệnh nhân vẫn được tiến hành điều trị ARV theo quy trình thường quy tại cơ sở điều trị. Nếu bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu, bệnh nhân ký xác nhận vào “Phiếu đồng ý tham gia vào nghiên cứu” (Phụ lục 10).
Kể từ lúc bắt đầu triển khai nghiên cứu tại cơ sở điều trị, các bệnh nhân đồng ý tham gia được lấy vào nhĩm nghiên cứu liên tục cho đến khi đạt được cỡ mẫu theo qui định. Nhằm đảm bảo tính bí mật tối đa cho bệnh nhân, mỗi bệnh nhân tham gia nghiên cứu cĩ một mã số nghiên cứu (HIVKT-MID) riêng biệt mà khơng ghi lại tên tuổi hay các thơng tin nhận dạng khác vào phiếu nghiên cứu. Mã số nghiên cứu được dán vào bệnh án, phiếu theo dõi cũng như các ống xét nghiệm.
2.2.3.2. Tiến trình nghiên cứu
Sơ đồ2.1. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu theo dõi HIV kháng thuốc
Thu thập mẫu tại thời điểm bắt đầu nghiên cứu (T1)
Tại thời điểm trước khi bắt đầu điều trị ARV, mỗi bệnh nhân được thu thập các thơng tin sau vào Phiếu thu thập thơng tin bệnh nhân tại thời điểm bắt đầu điều trị (Phụ lục 11):
- Đặc điểm nhân khẩu học, giai đoạn lâm sàng, số lượng tế bào CD4, tiền sử điều trị ARV, phác đồ ARV đã sử dụng và thời điểm bắt đầuđiều trị. Các biến số thu thập được trình bày tại mục 2.2.7.1. Các biến số nghiên cứu này được thu thập từ bệnh án ngoại trú của bệnh nhân.
- Thơng tin về việc thu thập, xử lý, vận chuyển và bảo quản mẫu.
nhân được tư vấn và lấymáu để tiến hành xét nghiệm tải lượng HIV. Các trường hợp cĩ xét nghiệm tải lượng HIV trên 1000 bản sao/ml được giải trình tự gen để làm xét nghiệm HIV kháng thuốc.
Trong thời gian theo dõi bệnh nhân từ T1 đến T2: Vào tất cả các lần bệnh nhân đến khám và lĩnh thuốc, các thơng tin về ngày hẹn khám và ngày đến được ghi nhận trong Phiếu ngày tái khám (Phụ lục 13)
Thu thập dữ liệu và lấy mẫu tại thời điểm kết thúc (T2): mỗi bệnh nhân được thu thập các thơng tin sau vào Phiếu thu thập thơng tin bệnh nhân tại thời điểm kết thúc điều trị (Phụ lục 12):
Thời điểm T2 là thời điểm bệnh nhân duy trì phác đồ ARV bậc 1 sau 12 tháng điều trị ARV phác đồ bậc 1 hoặc được chuyển sang phác đồ bậc 2 nhưng vẫn nằm trong 12 tháng sau điều trị ARV phác đồ bậc 1. Các xét nghiêm liên quan đến quá trình theo dõi bệnh nhân như xét nghiệm tế bào TCD4, sinh hĩa, huyết học được làm theo quy trình bình thường của phịng khám.
Tại thời điểm này, các bệnh nhân được:
- Thu thập thơng tin về tuân thủ điều trị trong vịng 30 ngày trước thời điểm T2 (phụ lục 14)
- Lấy máu xét nghiệm tải lượng vi rút.Các mẫu cĩ tải lượng HIV>1.000 bản sao/ml đượcgiải trình tự gen và làm xét nghiệm gen HIV kháng thuốc.
- Thời điểm bắt đầu và thời điểm kết thúc nghiên cứu được ghi trực tiếp vào “Phiếu thu thập thơng tin bệnh nhân tại thời điểm bắt đầu và kết thúc”. Tất cả các phân loại bệnh nhân tại thời điểm kết thúc của cơ sở điều trị được ghi nhận và xác minh trong quá trình phân tích.
- Tổng số cĩ 501 BN được thu thập theo mã số nghiên cứu (phụ lục 16)
2.2.3.3. Thu thập, vận chuyển, xử lý và theo dõi mẫu
vào buổi sáng của ngày nhận thuốc ARV đầu tiên.
- Tại thời điểm T2: các bệnh nhân vẫn cịn duy trì phác đồ bậc 1 ở 12 tháng sau khi bắt đầu sử dụng thuốc ARV hoặc các bệnh nhân chuyển sang phác đồ bậc 2 được tiến hành lấy máu. Mẫu máu thu thập từ bệnh nhân chuyển sang phác đồ bậc 2 được lấy trước khi bệnh nhân uống thuốc ARV phác đồ bậc 2.
Bệnh nhân được lấy 6 ml máu để làm tải lượng HIV và xét nghiệm HIV kháng thuốc. Mỗi nhĩm bệnh nhân đều được hẹn tái khám, nhận thuốc cùng một ngày, do vậy các mẫu của nhĩm bệnh nhân vẫn cịn duy trì phác đồ bậc 1 sau 12 tháng điều trị được lấy trong cùng một ngày. Với các bệnh nhân khơng đến tái khám và nhận thuốc theo lịch (cĩ thể sớm hoặc trễhơn) cũng được lấy mẫu và vận chuyển về phịng xét nghiệm để được tách huyết tương và lưu vào tủ âm sâu.
Quy trình lấy mẫu được thực hiện theo đúng quy định về thực hành tốt phịng xét nghiệm đối với xét nghiệm sinh học phân tử (GLP).
Các mẫu lấy tại thời điểm kết thúc cho những bệnh nhân chuyển sang phác đồ bậc 2 và những bệnh nhân cịn duy trì phác đồ điều trị ARV bậc 1 tại thời điểm 12 tháng được đo tải lượng virút và những mẫu cĩ tải lượng virút≥1000 bản sao/ml được làm xét nghiệm HIV kháng thuốc xác định tỷ lệ đột biến HIV kháng thuốc sau một năm điều trị ARV.
Các mẫu được làm xét nghiệm tải lượng HIV và xét nghiệm gen HIV kháng thuốc tại phịng xét nghiệm sinh học phân tử của Viện Pasteur Tp. HCM. Đây là phịng xét nghiệm được Tổ chức Y tế thế giới cơng nhận là phịng xét nghiệm định gen HIV kháng thuốc đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới vào năm 2012. Các kỹ thuật xét nghiệm tải lượng virút tại Viện Pastuer đã được chuẩn thức sau khi tham gia vào hệ thống kiểm tra chất lượng quốc tế (EQA): ARN được tách chiết bằng hệ thống máy tách chiết tự động MagNA Pure - Roche. Sử dụng kỹ thuật real- time RT-PCR với kit GeneriqueCharge Viral – Biocentricđể xác định nồng độ HIV ARN tự do trong máu.
Quy trình tổ chức lấy mẫu được trình bày trong Sơ đồ2.2.
Sơ đồ2.2. Sơ đồ lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu trong nghiên cứu
Những bệnh phẩm cĩ nồng độ HIV-ARN ≥1000 bản sao/ml (tương đuơng 3logbảnsao/mL) được khuếch đại và giải trình tự trên vùng gen Pol (~1800bp) bao gồm tồn bộ gen Prot (protease)và tối thiểu 250 codon đầu của gen RT (reverse transcriptas). Đây là 2 gen liên quan đến đích tác động của thuốc ARV trong chu trình nhân lên của HIV.
Chuỗigen của các mẫu giải trình tự thành cơng sẽ được phân tích bằng phần mềm Seqman – DNASTAR V9.0, sau đĩ được nhập vào ngân hàng dữ liệu trực tuyến về HIVKT – Stanford phiên bản tháng 5/2013 để đánh giá tình trạng kháng
thuốc. Đối với từng trình tự, ngân hàng Stanford cung cấp danh sách những đột biến kháng và mức độ kháng với từng thuốc. Mỗi đột biến kháng sẽ được tính điểm gây kháng với từng thuốc (mutation scoring), mức độ kháng đối với từng thuốc được đánh giá dựa trên tổng điểm của tất cả các đột biến được phân thành 5 cấp độ: 1) Nhạy; 2) Cĩ khả năng kháng thấp; 3) Kháng mức độ thấp; 4) Kháng mức độ trung bình và 5) Kháng mức độ cao.
Cách tính mức độ kháng đối với thuốc ARV của các đột biến HIV kháng thuốc được đối chiếu với ngân hàng Stanford và được trình bày trong Hình 2.1.
Hình 2.1. Phương pháp xác định
mức độ kháng với thuốc ARV của từng đột biến HIV kháng thuốc
Mỗi đột biến được tính điểm đối với từng thuốc
Ngân hàng Stanford cung cấp các đột biến kháng đối với từng nhĩm thuốc sau khi so sánh trình tự gen của mẫu với trình tự tham chiếu Mức độ kháng thuốc Mức độ kháng thuốc Bảng tính điểm gây kháng thuốc Mức độ kháng đối với 1 thuốc sẽđược tính dựa trên điểm tổng của tất cả các đột biến gây kháng thuốc đĩ Mỗi đột biến được tính điểm đối với từng thuốc
Kết quả này sẽ được lưu dưới dạng file excel cho từng mẫu. Thơng tin về các mẫu bệnh phẩm khơng giải trình tự gen bao gồm kết quả tải lượng vi rút, ngày khuếch đại và kết quả khuếch đại, và bất kỳ lý do nào về việc khơng chiết xuất hoặc khuếch đại. Những thơng tin này được giữ trong sổ ghi chép tại phịng thí nghiệm và chỉ cĩ các cán bộ cĩ trách nhiệm mới được truy cập.
2.2.3.4. Cơng cụ và vật liệu nghiên cứu
Bộ cơng cụ thu thập mẫu bao gồm:
- Mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu. Nếu bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ ký vào Phiếu cam kết tham gia nghiên cứu (phụ lục 10).
- Mẫu thu thập thơng tin tại thời điểm bắt đầu điều trị (T1): Mẫu này bao gồm các thơng tin về nhân khẩu học, giai đoạn lâm sàng, số lượng tế bào TCD4, tiền sử điều trị ARV, tình trạng thai nghén nếu là nữ, tình trạng mắc và điều trị lao, ngày và giờ lấy máu (phụ lục 11). Các thơng tin này được lấy từ bệnh án ngoại trú của bệnh nhân.
- Mẫu thu thập thơng tin tại thời điểm kết thúc nghiên cứu (T2): các thơng tin bao gồm tình trạng khi kết thúc, giai đoạn lâm sàng, số lượng TCD4 gần nhất, phác đồ ARV đang dùng, số lần chuyển đổi phác đồ giữa thời điểm ban đầu và thời điểm kết thúc, các phác đồ ARV đã được chuyển đổi, tình trạng mắc nhiễm trùng cơ hội giữa thời điểm ban đầu và thời điểm kết thúc, sự tuân thủ của bệnh nhân, số lần hẹn tái khám và số lần đến tái khám đúng hẹn, số lần hẹn lĩnh thuốc và số lần lĩnh thuốc đúng hẹn, ngày và giờ lấy máu (phụ lục 12).
- Mẫu thơng tin về tái khám và lĩnh thuốc: Các thơng tin về ngày tái khám và ngày lĩnh thuốc của bệnh nhân được ghi lại trong mẫu này. Các thơng tin được lấy trong các lần bệnh nhân đến tái khám và lĩnh thuốc (phụ lục 13).
- Mẫu thu thập thơng tin về tuân thủ điều trị: Mẫu này được thu thập vào thời điểm T2 trước khi bệnh nhân được lấy máu làm xét nghiệm. Các thơng tin bao gồm
tiền sử điều trị ARV của bệnh nhân trước đĩ, mức độ tuân thủ của bệnh nhân khi uống thuốc ARV trong vịng 30 ngày trở lại ngày phỏng vấn (phụ lục 14).