CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Để xác định THC-COOH trong máu, cần khảo sát các điều kiện môi trường pH để chiết lỏng - lỏng, dung môi chiết, hiệu suất chiết, và điều kiện trước khi đưa vào phân tích bằng máy LC-MS/MS.
Phân tích hàm lượng THC-COOH trong máu bằng quy trình đã lựa chọn được trên LC-MS/MS.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu máu nghi sử dụng cần sa. Các mẫu máu đều được thử phản ứng miễn dịch với kít thử cần sa.
2.1.3. Mẫu nghiên cứu
Huyết tương là một trong hai thành phần chính của mơ máu, là dịch chứa các thành phần vơ hình và hịa tan rất nhiều protein, hormone và các chất khác, hay huyết tương bao gồm huyết thanh và các yếu tố đông máu.
Luận văn sử dụng mẫu huyết tương người để xây dựng quy trình phân tích khảo sát và đánh giá phương pháp phân tích THC-COOH.
2.1.4. Nội dung nghiên cứu
Sau khi chiết THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích trên LC-MS/MS. Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC- COOH, để xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong máu bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ kép, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu:
- Khảo sát dung môi chiết.
- Khảo sát môi trường chiết (pH). - Đánh giá hiệu quả chiết.
- Xây dựng đường chuẩn định lượng của THC-COOH.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Đánh giá tính phù hợp của phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối, hiệu
suất thu hồi…
- Ứng dụng: Phân tích trên các mẫu máu của người nghi sử dụng Cần sa bị bắt giữ.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Mẫu chuẩn THC-COOH 0,1 mg/ml, THC-COOH-d3 1 mg/ml Arlesheim, Thụy Sỹ do Liên hợp quốc cấp với lượng chính xác là 0,1 mg.
- Các hóa chất cịn lại đều là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (đạt tiêu chuẩn PA):
+ Axit TCA tinh khiết 99%. + Muối Amoniacetat
+ Muối khan Na2SO4 (Merck, Đức) được nung ở 2500C trong 2h trước khi sử dụng.
+ Nước cất hai lần.
+ Khí N2 kỹ thuật 99% dùng để đuổi dung môi.
+ Các dung môi tinh khiết: Etylaxetat, methanol, hexanee (Merck, Đức). + Kít thử miễn dịch Acon, Mỹ.
- Cách pha dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc, các dung dịch chuẩn ở nồng độ khác nhau, dung dịch nội chuẩn như sau:
+ Pha các dung dịch chuẩn và dung dịch axit TCA * Pha dung dịch chuẩn gốc 5 µg/ml:
Dung dịch chuẩn gốc nồng độ 5 µg/ml được chuẩn bị như sau: Hút 0,5ml dung dịch chuẩn 100 µg/ml vào bình định mức, sau đó dùng CH3OH định mức đến 10ml, được nồng độ 5 µg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 2 - 4oC
* Pha dung dịch chuẩn làm việc 0,5 µg/ml:
Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc 5 µg/ml vào bình định mức, sau đó dùng CH3OH định mức đến 10ml, được nồng độ 0,5 µg/ml. Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản ở 2 - 4oC.
* Pha dung dịch chuẩn kiểm tra 0,1 µg/ml:
Hút 0,01ml (10 µl) dung dịch chuẩn 100 µg/ml vào bình định mức, sau đó sau đó dùng CH3OH định mức đến 10 ml, được nồng độ 0,1 µg/ml. Dung dịch chuẩn kiểm tra được bảo quản ở 2 - 4oC.
* Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 5; 10; 25; 50; 100; 400 ng/ml: được pha từ dung dịch chuẩn làm việc trong dung môi là methanol hoặc pha trong nền mẫu trắng. Các dung dịch này chỉ pha khi sử dụng.
+ Pha dung dịch nội chuẩn:
* Pha dung dịch nội chuẩn gốc 1000 ng/ml: Hút 0,1 ml dung dịch nội chuẩn có sẵn cho vào bình định mức, sau đó dùng CH3OH định mức đến 10ml, được nồng độ 1000 ng/ml. Dung dịch nội chuẩn gốc được bảo quản ở 2 - 4oC.
* Pha dung dịch nội chuẩn làm việc 100 ng/ml: Hút 1 ml dung dịch nội chuẩn gốc cho vào bình định mức, sau đó dùng CH3OH định mức đến 10 ml, được nồng độ 100 ng/ml. Dung dịch nội chuẩn làm việc được bảo quản ở 2 - 4oC.
+ Pha dung dịch axit TCA ở pH từ 1 đến 5:
Tiến hành cân 1gam axit TCA pha thành 100 ml dung dịch axit TCA ở nồng độ 1% để đạt pH = 1, sau đó pha lỗng dung dịch dùng máy đo pH để có dung dịch pH = 2, 3, 4 và 5
Sau khi phân tích và dựng đường chuẩn, sẽ sử dụng các kết quả nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn cho mục đích phân tích định lượng THC-COOH có mặt trong máu của đối tượng sử dụng cần sa.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Ống nhựa ly tâm có nắp loại 10 ml. - Bình định mức 10 ml.
- Pipet, ống đong các loại, phễu chiết, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh bình định mức các loại.
- Máy đo pH Thermo scientific, Mỹ. - Tủ sấy, tủ ấm.
- Cân phân tích Sartorius CPA 225D có độ chính xác 10-5. - Máy điều nhiệt Memmer, Germany.
- Máy cô quay Eyela, Japan. - Máy siêu âm Branson 1510. - Máy lắc Unitwist 300.
- Máy LC-MS/MS Bruker, Mode: EVOQ Qube TM+HPLC Advance của Bruker (Mỹ).
2.3. Phương pháp thực nghiệm:
2.3.1.Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
- Mẫu trắng: là mẫu huyết tương được lấy từ những người khỏe mạnh, không sử dụng bất cứ loại ma túy nào.
- Mẫu thêm chuẩn: là mẫu trắng được thêm 1 lượng xác định THC- COOH chuẩn.
- Mẫu thực tế: Mẫu máu được lấy từ các đối tượng nghi đã sử dụng cần sa của các đơn vị bắt được, sau đó kiểm tra sơ bộ bằng que thử, mẫu nào dương tính với cần sa sẽ dùng để tiến hành phân tích.
Các mẫu đều ghi đầy đủ thông tin về tên, độ tuổi, tiền sử sử dụng và ngày sử dụng gần đây nhất và ngày lấy mẫu. Các mẫu đều được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC đến khi phân tích.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
Phân tích với đối tượng mẫu phức tạp như mẫu sinh học, quá trình chuẩn bị mẫu phải hết sức cẩn thận, tốn nhiều thời gian nhất. Nó quyết định đến nhiều đại lượng của phương pháp phân tích.
Đặc biệt đối với mẫu máu, có thể tích mẫu hạn chế, kết quả thử nghiệm liên quan đến tích pháp lý của các vụ án và các quy định của pháp luật nên quy trình chuẩn bị mẫu phải tuân thủ điều kiện khắt khe. Từng bước tiến hành
thí nghiệm cần cẩn thận, tỉ mỉ và quá trình tách chiết cần loại bỏ được các protein, lipit, chất mang màu cùng các chất hữu cơ gây cản trở khác
Để tăng độ nhạy của phép phân tích, q trình kết tủa protein và chiết cần được thực hiện cẩn thận. Trước khi kết tủa protein mẫu, cần đo thể tích, quan sát mẫu.
Mẫu được xử lý theo 2 bước như sau:
- Bước 1: Kết tủa protein, lấy 1 ml máu vào ống nhựa, thêm 1 ml dung dịch TCA (kết tủa protein và điều chỉnh pH chiết ) và 10 µl IS, đậy kín và lắc, sau đó ly tâm, thu lớp trên, sau đó cho 3ml dung mơi vào để tiến hành chiết lỏng - lỏng.
- Bước 2: Mẫu sau khi được chiết, ly tâm, tách phần dung dịch hữu cơ, loại nước bằng Na2SO4 khan, đem cô khô dưới đèn hồng ngoại, hịa tan mẫu bằng 20µl CH3OH, lọc mẫu qua fillter và cho vào ampul. Sau đó bơm 2 µl để phân tích sắc kí lỏng khối phổ kép.
2.4. Thực nghiệm:
2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS
Thiết bị dùng phân tích trong đề tài này là LC-MS-MS của hãng Bruker- Mỹ. Máy được thiết kế giúp định lượng một cách tin cậy và hiệu quả cho hàng ngàn mẫu thực trong thời gian nhanh nhất có thể. Chế độ nguồn Ion hóa ESI MRM (-). Hệ thống sắc ký lỏng được vận hành ở chế độ Gradient với tốc độ dòng 0,4 ml/ phút và áp suất tối đa 8000 PSI.
Các thí nghiệm khảo sát tìm điều kiện tối ưu của hệ thống LC-MS/MS được tiến hành với mẫu chuẩn và nội chuẩn được pha trong dung môi methanol.
- Khảo sát các mảnh phổ đặc trưng, lựa chọn mảnh ion định lượng của THC-COOH, THC-COOH-d3 và các điều kiện khối phổ: Bơm trực tiếp 200 μl các dung dịch chuẩn đơn các chất THC-COOH và THC-COOH-d3 nồng độ 100 ng/ml vào buồng MS.
- Khảo sát, lựa chọn pha động:
Tiến hành khảo sát 3 hệ pha động hệ 1, hệ 2 và hệ 3 có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các peak cân đối thuận lợi cho phân tích định
lượng. Các điều kiện khảo sát này được tham khảo từ các nghiên cứu trước đây [8, 19, 23]. Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn và nội chuẩn 100 ng/ml, tiến hành
khảo sát trên thiết bị.
+ Cột lựa chọn C18 100 mm x 2.1 mm ID 3 µm + Nhiệt độ cột: 400C
+ Nhiệt độ mẫu: 100C + Tốc độ dòng: 0,4 ml/p + Thể tích bơm mẫu: 2 µl
+ Tốc độ pha không đổi là 500 l/phút Hệ dung môi 1:
+ Mobile phase A (MPA): Amoniacetat 2 mM + Mobile phase B (MPB): ACN và MeOH (85:15) Hệ dung môi 2:
MPA: Amoniacetat 5 mM, MPB: ACN và MeOH (85:15) Hệ dung môi 3:
MPA: Amoniacetat 10 mM, MPB: ACN và MeOH (85:15)
Bảng 2. 1. Chương trình pha động gradient:
Thời gian (phút) A (%) B (%) 0.00 70 30 0.50 70 30 1.00 50 50 8.33 30 70 9.00 2 98 12.00 2 98 12.10 70 30 13.90 70 30
2.4.2. Khảo sát dung môi chiết
Để khảo sát dung môi tối ưu cho quá trình tách chiết, lấy 1 ml huyết tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH 200 ng/ml, dùng axit TCA vừa kết tủa protein vừa để điều chỉnh pH, thay đổi tỷ lệ dung môi gồm 100% hexanee và hỗn hợp hexanee/etylaxetate: 9:1, 8:2; 7:3; 6:4 và 5:5. Chiết các mẫu theo quy trình tại giá trị pH tối ưu là 4, thêm 10μl dung dịch THC- COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết. Làm khơ hồn tồn mẫu và hịa tan lại cặn bằng 20 μl dung môi methanol. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml khơng xử lý. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả bảng so sánh độ thu hồi giữa các tỉ lệ dung mơi được trình bày trong chương 3.
2.4.3. Khảo sát mơi trường (pH) chiết
Sau khi lựa chọn được hệ dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, cố định dung môi và khảo sát môi trường pH. Điều kiện pH dựa trên các nghiên cứu tham khảo, khảo sát ở các điều kiện pH như sau [8, 9].
Lấy 1 ml huyết tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH nồng độ 200 ng/ml, thêm 1 ml dung dịch axit TCA thay đổi pH từ 1, 2, 3, 4 và 5. Sau đó tiến hành chiết các mẫu theo quy trình xử lý mẫu bằng hệ dung mơi 9:1, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết. Làm khơ hồn tồn mẫu và hòa tan lại cặn bằng 20 μl dung môi. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml khơng xử lý. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả bảng so sánh độ thu hồi giữa các giá trị pH được trình bày trong chương 3.
2.4.4. Khảo sát độ thu hồi của phương pháp
Độ thu hồi của phương pháp thể hiện khả năng chiết THC-COOH từ mẫu máu theo phương pháp được chọn.
Khảo sát độ thu hồi của phương pháp được tiến hành: Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ở các nồng độ 25 ng/ml; 100 ng/ml và 400 ng/ml. Chiết các mẫu theo quy trình xử lý mẫu bằng hệ dung mơi 9:1 và tạo môi trường bằng axit TCA ở pH = 4. Nội chuẩn được thêm vào dịch rửa giải sau khi chiết xuất. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với các
hỗn hợp chuẩn có nồng độ tương ướng khơng xử lý. Kết quả bảng độ thu hồi giữa các giá trị nồng độ trình bày trong chương 3.
2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
Để đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu, tiến hành khảo sát trên các mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ở các hàm lượng thấp, trung bình và cao. Chuẩn bị mẫu huyết tương thêm chuẩn ở các nồng độ 25 ng/ml; 100 ng/ml; 400 ng/ml và các mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng. Chiết các mẫu theo quy trình xử lý mẫu bằng hệ dung mơi 9:1 và tạo môi trường bằng axit TCA ở pH = 4. Nội chuẩn được thêm vào dịch rửa giải sau khi chiết xuất. Tiến hành khảo sát trên thiết bị [24].
Kết quả tính theo cơng thức sau:
Ảnh hưởng nền mẫu được tính theo cơng thức: ME = a - b x 100
b Trong đó:
ME (matrix effect): ảnh hưởng nền (%).
a: tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích với nội chuẩn trong chiết xuất huyết tương.
b: tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích với nội chuẩn chiết pH = 4. Kết quả được trình bày trong chương 3.
2.5. Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp LC-MS/MS phân tích theo hướng dẫn thẩm định của dược điển Việt Nam, dược điển Châu Âu, hướng dẫn của UNODC…. Tiêu chí thẩm định phương pháp gồm [25, 26]:
2.5.1. Độ phù hợp của kệ thống sắc ký
Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có hàm lượng nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích peak của các lần sắc ký. Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) biểu thị chênh lệch diện tích peak, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu không lớn hơn 2,00 %.
2.5.2. Độ chọn lọc của phương pháp
Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng khơng được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
2.5.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có hàm lượng thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào hàm lượng. Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích peak thu được vào hàm lượng cho đến khi khơng cịn tuyến tính.
Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Các bước xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu:
- Lựa chọn nền mẫu trắng phù hợp với đối tượng thử, trong nghiên cứu này các đường chuẩn trên nền mẫu huyết tương.
- Pha dãy chuẩn trên nền mẫu trắng.
- Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu của từng chất và tín hiệu của nội chuẩn theo hàm lượng các chất tương ứng.
Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên:
- Hệ số tuyến tính R2 ≥ 0,99
- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn.
2.5.4. Độ đúng và độ chính xác
- Độ đúng R (%) được tính theo cơng thức:
𝑅% = Cm
x 100 Cc
Cc : Lượng THC-COOH chuẩn
Độ chính xác được biểu diễn theo hệ số biến thiên CV (%):
𝐶𝑉(%) = 𝐬
x̅x 100; với s =
Trong đó:
xi: Hàm lượng tính được của lần thử nghiệm thứ ―i
x̅ : Hàm lượng trung bình tính được của n lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm.
s: Độ lệch chuẩn.
2.5.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Trong nghiên cứu này, LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở hàm lượng thấp cịn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị.