Kết quả trên cho thấy, sự phụ thuộc tỉ lệ diện tích peak của chất chuẩn và
Nồng độ THC-COOH H ệ s ố f y = 0.0033x - 0.0057 R² = 0.9974 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 100 200 300 400
từ 5 – 400 ng/ml. Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường chuẩn có dạng y = 0,0033x – 0,0057 với hệ số tương quan R2 = 0,9974. Trong đó y là tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích và nội chuẩn, x là nồng độ THC-COOH trong huyết tương. Độ tuyến tính của đường chuẩn được thể hiện ở hình 3.7, khoảng tuyến tính của đường chuẩn tương đương với kết quả của nghiên cứu của Concheiro và cộng sự [20].
3.3.3. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phương pháp
Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) được sử dụng để đánh giá LOD và LOQ. LOD được xác định tại hàm lượng thu được S/N khoảng bằng 3; LOQ được xác định tại hàm lượng thu được S/N khoảng bằng 10.
Chuẩn bị các mẫu trắng thêm chuẩn và nội chuẩn ở các hàm lượng giảm dần 1ng/ml, 2ng/ml, 3ng/ml, 4ng/ml và 5ng/ml. Tiến hành xử lý, chiết xuất và phân tích theo quy trình. Xác định giá trị S/N của mẫu phân tích. Dựa vào S/N để ước lượng các giá trị LOD, LOQ của THC-COOH và THC-COOH lần lượt là 3ng/ml, 4ng/ml.
3.4. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị LC-MS/MS
Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đã công bố đã tối ưu các điều kiện khảo sát cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, hiệu suất thu hồi tốt đáp ứng được yêu cầu phân tích định tính và định lượng, do đó chúng tơi xây dựng được quy trình xử lý mẫu để phân tích THC-COOH trong mẫu máu của đối tượng bị bắt giữ như sau:
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình phân tích THC-COOH trong máu
3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế
Luận văn đã nghiên và xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong huyết tương xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng và bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS). Phương pháp cho hiệu suất thu hồi cao, độ ổn định và lặp lại tốt, giới hạn phát hiện đạt ngưỡng thấp 3 ng/ml, đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp chuẩn, do đó hồn tồn có thể sử dụng phương pháp này để phân tích và định lượng nồng độ THC-COOH trong máu của người sử dụng cần sa. Trong luận văn này tiến hành phân tích 9 mẫu thực tế
Sau khi đã xây dựng và thẩm định, quy trình được áp dụng để phân tích với 9 mẫu máu dương tính với que thử miễn dịch cần sa thu được từ các vụ án mà Cơ quan điều tra gửi đến Viện Khoa học hình sự. Các thơng tin về mẫu
Thêm 1ml TCA, pH=4, 10 μlIS 200 ng/ml
1 ml máu
Thu lớp dung dịch bên trên
Lắc trong 10 phút, ly tâm phân lớp
Thu dịch chiết, loại nước bằng Na2SO4 khan
Cô chân khơng, thu cặn chiết
Hịa tan cặn chiết bằng 20 µl CH3OH, Lọc qua fillter Thêm 3ml hexan/etylaxetate (9:1, v/v) Bơm 2 µl vào LC-MS/MS Lắc xốy mẫu 10 phút, sau đó ly tâm
khơng được đưa vào luận văn và đã được mã hóa từ M1 - M9 để đảm bảo tính bảo mật thơng tin. Kết quả thu được trong bảng 3.8 dưới đây.
Bảng 3. 8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực
TT STHC-COOH/ STHC-
COOH- d3
Khối lượng THC-COOH (ng/ml) M1 0.088 25,61 M2 0.136 40,15 M3 0.147 43,48 M4 0.164 48,64 M5 0.083 24,09 M6 0.144 42,58 M7 0.152 45,00 M8 0.148 43,79 M9 0.082 23,79
Trên sắc đồ các mẫu máu, chất THC-COOH được xác định thông qua thời gian lưu và phổ khối của chúng. Kết quả phân tích 9 mẫu dương tính que thử miễn dịch cần sa cho thấy tất cả các mẫu máu được kiểm tra đều có ma túy. Đối tượng có tiền sử sử dụng cần sa và đối tượng mới sử dụng cần sa có hàm lượng THC-COOH được phát hiện với hàm lượng cao hơn các đối tượng ít sử dụng tại thời điểm lấy mẫu.
Kết quả thực nghiệm cho thấy, phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng và thẩm định phù hợp để định lượng THC-COOH trong máu những người sử dụng. Phương pháp có độ đặc hiệu, chọn lọc và độ đúng cao, thích hợp để xác định hàm lượng chất THC-COOH trong máu người sử dụng.
Từ kết quả hàm lượng THC-COOH thu được trên một số mẫu máu có thể đánh giá lại được tiền sử và mức độ sử dụng cần sa của đối tượng.
3.6. Đánh giá đối tượng mẫu phân tích, phương pháp phân tích LC-MS/MS và đóng góp mới của đề tài. MS/MS và đóng góp mới của đề tài.
3.6.1. Đánh giá đối tượng mẫu phân tích và phương pháp phân tích LC-MS/MS MS/MS
Để xác định người có sử dụng ma túy hay khơng thì mẫu để phân tích giám định thường là mẫu dịch sinh học như máu, nước tiểu, nước bọt, mồ hơi hoặc lơng, tóc hay móng tay… Thường trong xét nghiệm, mẫu nước tiểu và mẫu máu hay được sử dụng do liên quan đến khả năng hấp thu và chuyển hóa của các chất ma túy trong cơ thể.
Phân tích giám định ma túy trong dịch sinh học là cơng việc khó phức tạp bởi có rất nhiều loại ma túy được sử dụng bất hợp pháp trên thế giới. Mỗi nhóm chất ma túy thường phải có quy trình phân tích giám định riêng. Các chất ma túy tồn tại trong dịch sinh học thường có hàm lượng rất thấp và khác nhau. Mặt khác, dịch sinh học có chứa rất nhiều thành phần phức tạp có thể ảnh hưởng đến các chất phân tích do vậy phải có quy trình chiết thích hợp để chiết tối đa các chất ma túy và nền mẫu khơng ảnh hưởng đến kết quả phân tích [25, 26].
Trong luận văn này sử dụng mẫu phân tích là máu do mẫu có ưu điểm là dễ dàng đánh giá kết quả hơn so với mẫu nước tiểu, hơn nữa một số chất bài tiết ra nước tiểu với lượng rất nhỏ rất khó phân tích. Mẫu máu thường được áp dụng trong các trường hợp tử vong. Nhưng có những nhược điểm so với việc thu thập mẫu nước tiểu để phân tích, đối với mẫu nước tiểu phát hiện được sau hàng ngày tính từ lần sử dụng cuối cùng, mẫu dễ thu và dễ bảo quản hơn so mẫu máu, thể tích mẫu nước tiểu thu được nhiều hơn thì thuận tiện trong quá trình phân tích vì có lượng mẫu lớn khoảng vài chục mililit đến vài trăm mililit, quá trình xử lý mẫu nước tiểu sẽ đơn giản hơn mẫu máu như không cần kết tủa protein. Cịn đối với mẫu máu thì thể tích thu được trong quá trình giám định chỉ được vài mililit. Mẫu máu phát hiện được sau hàng giờ tính từ lần sử dụng cuối cùng, mẫu khó thu (phải do nhân viên y tế thu ở người sống hoặc bác sỹ pháp y thu ở tử thi). Trong những trường hợp đối tượng sử dụng ma túy khơng thể thu được mẫu nước tiểu thì phải tiến hành thu mẫu máu. Sự kết hợp phân tích ma túy trong nước tiểu và máu nhằm phục vụ trong cơng tác điều tra hình sự, mặt khác sẽ có đánh giá được mức độ, tần
suất sử dụng ma túy của các đối tượng, do đó rất có ích đối với cơng tác phịng chống và điều trị ma túy đối với các đối tượng sử dụng [25].
Phương pháp LC-MS/MS không thể xác định được trực tiếp các chất ma túy trong dịch sinh học, trong luận văn này dịch sinh học phân tích là máu. Để phân tích được chất ma túy phải được qua các bước xử lý mẫu và chiết tách khỏi mẫu máu. Quá trình xử lý và chiết tách trải qua nhiều công đoạn và tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc nhiều yếu tố. Để giảm thiểu sai số, chất nội chuẩn được sử dụng trong suốt quá trình xử lý, chiết xuất và phân tích sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép, nội chuẩn tốt nhất là nội chuẩn đồng vị của từng chất, khi đó chất phân tích và nội chuẩn có tính chất hóa lý giống nhau nhưng khác nhau về số khối, do đó hiệu suất thu hồi của nội chuẩn và chất phân tích gần như tương đương nhau khi áp dụng cùng quy trình xử lý mẫu. Trong đề tài nghiên cứu này, chất THC-COOH-d3 được lựa chọn làm nội chuẩn tương ứng THC-COOH. Thời gian lưu của 2 chất trùng nhau không ảnh hưởng do khối phổ phân tích các chất dựa trên các mảnh phổ đặc trưng của từng chất.
Với những kết quả tin cậy đạt được qua quá trình khảo sát các yếu tố cũng như xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong mẫu máu của người sử dụng cần sa bằng sắc ký lỏng khối phổ kép, phương pháp có thể áp dụng và triển khai tại các phịng thí nghiệm của địa phương để phục vụ cho công tác giám định ma túy.
Tiến hành phân tích THC-COOH trong các đối tượng mẫu máu, nước tiểu trên thiết bị HPLC, LC-MS/MS đã giảm bớt bước dẫn xuất hóa so với việc phân tích trên thiết bị GC-MS.
3.6.2. Đóng góp mới của đề tài
Qua nghiên cứu xác định THC-COOH trong máu, một chất chuyển hóa của cần sa trong máu để khẳng định đối tượng sử dụng cần sa. Tuy trong luận văn còn nhiều điểm khiêm tốn nhưng đã có những đóng góp mới như sau:
- Lần đầu tiên phân tích chất chuyển hóa THC-COOH của cần sa trong máu bằng LC-MS/MS. Đề tài là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phân tích một chất chuyển hóa THC-COOH của cần sa trong máu bằng LC-MS/MS không sử dụng tác nhân dẫn xuất. Đề tài đã xây dựng được quy trình phân
tích máu bằng cách sử dụng axit TCA để vừa kết tủa protein vừa dùng tạo môi trường pH chiết để giảm thiểu bước xử lý mẫu để tránh thao tác nhiều bước dẫn đến mất mẫu. Với phương pháp này, chất phân tích được thu hồi với hiệu suất cao (82,4%).
- Kết quả phân tích mẫu máu của 09 mẫu thực tế thu thập được trong quá trình giám định. Tuy lượng mẫu thực tế thu thập được không nhiều do đề tài thực hiện trong tình hình dịch bệnh phức tạp, việc các cơ quan trưng cầu ở các địa phương đến trưng cầu gặp nhiều khó khăn trong vấn đề đi lại nên hạn chế phần nào số lượng mẫu gửi đến cơ quan giám định. Thông qua các mẫu giám định thực tế đã đóng góp một phần trong cơng tác điều tra hình sự. Việc xây dựng thành công phương pháp xác định THC-COOH trong mẫu máu góp phần khơng nhỏ trong cơng cuộc đấu tranh phòng chống ma túy tại Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Luận văn đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả như sau:
- Xác định các điều kiện LC-MS/MS để phân tích THC-COOH. Chất phân tích được tách bằng sắc ký lỏng với pha động theo gradient nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu 2 µl, chế độ khơng chia dịng; phát hiện và định lượng bằng MS với nguồn ion hóa ESI (-), sử dụng kỹ thuật ghi phổ MRM.
- Xây dựng được quy trình xử lý mẫu máu, xây dựng được điều kiện chiết lỏng – lỏng THC-COOH trong mẫu máu với thể tích mẫu 1 ml máu, pH = 4 và hệ dung mơi hexanee/etylaxetate (9/1), thể tích 3 ml.
- Đã thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao, có khả năng xác định chất THC-COOH tại hàm lượng thấp hơn 5 ng/ml; ảnh hưởng của nền mẫu nằm trong khoảng ± 15 % và giá trị RSD (%) nhỏ hơn 15%; có độ thu hồi từ 78,2% đến 82,4%.
- Xây dựng được đường chuẩn phân tích định lượng THC-COOH trong khoảng 5-400 ng/ml với hệ số tương quan r2 = 0,9976.
- Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đối với THC-COOH và THC-COOH-d3 là LOD= 3 ng/ml; LOQ = 4 ng/ml.
- Đánh giá được tính phù hợp của phương pháp với RSD ở hai điểm nồng độ đầu và nồng độ cuối của đường chuẩn nhỏ (10,4% và 1,9%).
- Xây dựng được quy trình phân tích THC-COOH trong mẫu máu của người sử dụng cần sa.
- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu máu nghi sử dụng cần sa với hàm lượng từ 23,79 ng/ml – 48,61 ng/ml tùy thuộc vào tiền sử sử dụng cần sa và thời gian tính từ thời điểm sử dụng lần cuối đến thời điểm lấy mẫu nước tiểu phân tích bao lâu.
- Kết quả của đề tài đã được chấp nhận đăng 01 bài báo trên Tạp chí Phân tích Hóa Lý và Sinh học vào tháng 12 năm 2021.
Kiến nghị
Cho đến nay, phân tích các chất ma túy trong dịch sinh học vẫn là vấn đề khó trong giám định ma túy nói chung. Tuy nhiên, việc phân tích chất chuyển hóa của cần sa này trong máu đang là xu hướng của các phịng giám định ma túy trên tồn thế giới. Để đảm bảo việc phân tích được khách quan, chính xác và thực hiện hiệu quả cơng tác phịng chống ma túy ở Việt Nam, chúng tơi có một số kiến nghị sau:
✓ Áp dụng phân tích chất THC-COOH trong máu tại một số cơ sở có đủ điều kiện ở địa phương.
✓ Tiến hành kiểm tra đại trà các đối tượng nghi ngờ sử dụng ma túy tại các vũ trường, sàn nhảy và những người lái xe khi tham gia giao thông.
✓ Tiếp tục khảo sát sâu hơn về chiết mẫu từ trong máu đặc biệt là loại bỏ protein trong nền mẫu.
✓ Tiếp tục nghiên cứu phân tích các chất chuyển hóa của cần sa và các nhóm ma túy khác trong các loại mẫu khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Coulter, C., M. Garnier, and C. Moore, 2012, Analysis of tetrahydrocannabinol and its metabolite, 11-nor-Δ⁹-tetrahydrocannabinol-9- carboxylic acid, in oral fluid using liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J Anal Toxicol. 36(6): p. 413-7.
2. UNODC, 2009, Recommended Methods for the Identification and Analysis
of Cannabis and Cannabis Products. New York: United Nations.
3. Huestis, M.A., J.E. Henningfield, and E.J. Cone, 1992, Blood cannabinoids. i. absorption of thc and formation of 11-oh-thc and thccooh during and after smoking marijuana. Journal of Analytical Toxicology.
16(5): p. 276-282.
4. Musshoff, F. and B. Madea, 2006, Review of biologic matrices (urine, blood, hair) as indicators of recent or ongoing cannabis use. Ther Drug Monit. 28(2): p. 155-63.
5. Stout, P.R., C.K. Horn, and K.L. Klette, 2001, Solid-phase extraction and GC-MS analysis of THC-COOH method optimized for a high-throughput forensic drug-testing laboratory. J Anal Toxicol. 25(7): p. 550-4.
6. Chu, M.H. and O.H. Drummer, 2002, Determination of delta9-THC in whole blood using gas chromatography-mass spectrometry. J Anal Toxicol. 26(8): p. 575-81.
7. Del Mar Ramirez Fernandez, M., et al., 2008, Simultaneous analysis of THC and its metabolites in blood using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.
875(2): p. 465-70.
8. Chebbah, C., et al., 2010, Direct quantification of 11-nor-Delta(9)- tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in relation to doping control analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 24(8): p. 1133-41.
9. Tully, A. Examination of Concentrations of THC and its Major Metabolites
in Postmortem Blood Using Solid-Phase Extraction Preparation Methods and Analysis by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.
2018. University of Colorado Colorado Springs.
10. Spindle, T.R., et al., 2020, Pharmacokinetics of cannabis brownies: A controlled examination of Δ9-tetrahydrocanna-binol and metabolites in blood and oral fluid of healthy adult males and females. Journal of Analytical Toxicology. 44(7): p. 661-671.
11. Sears, R.M., Solid phase extraction of THC, THC-COOH and 11-OH- THC from whole blood, Agilent, Editor. 2010.
12. Han, E., et al., 2011, Simultaneous analysis of Δ(9)- tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol in hair without different sample preparation and derivatization by gas
chromatography-tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 55(5):