Trong kỹ thuật phân tích THC-COOH, có rất nhiều axit có thể dùng tạo mơi trường pH để chiết, nhưng ở luận văn này chúng tôi tiến hành dùng axit TCA để đạt 2 mục đích là vừa kết tủa protein vừa tạo mơi trường pH. Vì mẫu máu trong thực tế giám định chỉ thu được lượng nhỏ nên dùng axit TCA để giảm việc kết tủa protein rồi tạo môi trường pH chiết để tránh mất mẫu khi qua nhiều bước xử lý mẫu. Kết quả thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.5 cho thấy độ thu hồi của chất phân tích tăng khi pH tăng từ 1 đến 4 và đạt cao nhất tại pH = 4, sau đó tăng tiếp pH đến 5 thì độ thu hồi của chất phân tích giảm xuống. Như vậy ở mơi trường chiết pH = 4, độ thu hồi chất phân tích là cao nhất, đồng thời lượng tạp chất trên sắc đồ cũng ít nhất cho thấy khả năng chiết THC-COOH ở môi trường pH = 4 cho kết quả tốt nhất. Nhìn chung với pH axit sẽ cho phép tách THC-COOH ra khỏi mẫu máu đi vào pha dung môi hexanee, 10% ethylacetate giúp tạo ái lực và chuyển pha giữa phân cực sang không phân cực tốt hơn. Kết quả nghiên cứu này cũng tương đương kết quả phân tích hàm lượng THC-COOH trong móng tay của Kim và cộng sự [28, 29].
Vì vậy, lựa chọn dung dịch axit TCA ở pH = 4 làm môi trường chiết và để kết tủa prorein trong mẫu máu là tốt nhất.
3.2.3. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp
Độ thu hồi của phương pháp được xác định và tính tốn tại hàm lượng thấp, trung bình và cao đối với mỗi chất phân tích bằng tỉ số trung bình
51.5 65.7 64.9 81.1 74.4 0 20 40 60 80 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H iệ u s u ấ t th u hồi H (% ) pH
của tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích và nội chuẩn trong mẫu huyết tương qua quá trình xử lý và chiết xuất với tỉ lệ diện tích peak của chất chuẩn và nội chuẩn khơng qua q trình xử lý và chiết xuất.
Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ở các nồng độ 25 ng/ml; 100 ng/ml và 400 ng/ml. Chiết các mẫu theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, tiến hành ở điều kiện pH và dung môi như đã khảo sát ở trên ở mục 3.2.1 và 3.2.2. Dung dịch nội chuẩn 100 ng/ml được cho vào sau khi đã xử lý và chiết mẫu. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với các hỗn hợp chuẩn có nồng độ tương ướng khơng xử lý. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình
Bảng 3. 4. Độ thu hồi chất phân tích trong máu
Hàm lượng (ng/ml) STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Chiết STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Ko chiết RSD (%) Độ thu hồi (%) 5 0,082 0,101 2,47 78,2 100 0,281 0,341 4,63 82,4 400 1,324 1,613 1,66 82,1
Kết quả độ thu hồi của chất phân tích trong mẫu máu ở các hàm lượng
thấp, trung bình và cao đều đạt trong khoảng từ 78,2% đến 82,4% và RSD nhỏ hơn 15%. Như vậy phương pháp có độ thu hồi cao và lặp lại.
3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu
Nền mẫu huyết tương rất phức tạp, có chứa rất nhiều protein, các cation cơ bản như canxi, natri, magie. Các yếu tố này có ảnh hưởng rất lớn tới tín hiệu THC-COOH khi phân tích. Do vậy nếu mẫu khơng được xử lý tốt sẽ ảnh hưởng tới kết quả phân tích bằng LC-MS/MS. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu nhằm đảm bảo việc phân tích khơng bị ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng của nền mẫu là có thể chấp nhận được đối với phương pháp đã nghiên cứu [25, 26].
Để đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu, chuẩn bị mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ở các nồng độ 25 ng/ml; 100 ng/ml; 400 ng/ml và các mẫu
xây dựng, tiến hành ở điều kiện pH và dung môi như đã khảo sát ở trên ở mục 3.2.1 và 3.2.2. Dung dịch nội chuẩn 100 ng/ml được cho vào tất cả các mẫu sau khi đã được xử lý và chiết xuất. Tiến hành khảo sát trên thiết bị.
Ảnh hưởng của nền mẫu đến chất phân tích được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của nền mẫu
Hàm lượng (ng/ml) Ảnh hưởng của nền mẫu (%)
RSD (%)
5 -0,19 7,3
100 -0,18 6,4
400 -0,27 5,4
Kết quả khảo sát cho thấy, ở ba mức hàm lượng thấp, trung bình và cao của chất phân tích trong mẫu huyết tương cho ảnh hưởng của nền mẫu nằm trong khoảng ± 15 % và giá trị RSD (%) nhỏ hơn 15%. Như vậy, phương pháp xử lý mẫu phù hợp, nền mẫu ảnh hưởng chấp nhận được đến kết quả phân tích THC-COOH trong mẫu máu.
3.3. Thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích THC-COOH trong mẫu máu bằng LC-MS/MS trong mẫu máu bằng LC-MS/MS
3.3.1. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng THC-COOH trong máu trong máu
3.3.1.1. Độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS
Độ phù hợp của hệ thống được đánh giá bằng cách tiêm lặp lại 6 lần hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml và đánh giá hệ số biến thiên của thời gian lưu và tỉ lệ diện tích peak sắc ký. Kết quả thu được tính tốn theo cơng thức % RSD = 𝑆𝐷
𝑋̅ . 100%.
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp STT 100ng/ml STT 100ng/ml tR (phút) STHC-COOH/ STHC-COOH-d3 1 3,368 0,341 2 3,375 0,356 3 3,350 0,367 4 3,355 0,356 5 3,352 0,326 6 3,342 0,340 TB 3,357 0,340 RSD (%) 0.33 3,74
Hệ số biến thiên của tỉ lệ diện tích peak 3,74 đáp ứng yêu cầu để ứng dựng phương pháp khối phổ (≤5%), trong khi hệ số biến thiên của thời gian lưu rất thấp (< 1 %) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng u cầu phân tích đềra. Như vậy hệ thống sắc ký phù hợp, có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, áp dụng được cho phân tích định tính và định lượng trên sắc ký được.
3.3.1.2. Độ chọn lọc
Phân tích mẫu chuẩn, mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương thêm chuẩn và nội chuẩn rùi tiến hành chiết các mẫu theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, tiến hành ở điều kiện pH và dung môi như đã khảo sát ở trên ở mục 3.2.1 và 3.2.2. Theo yêu cầu, mẫu trắng phải khơng được cho tín hiệu chất phân tích, trong khi mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn [30].
Chuẩn bị 03 mẫu gồm: Hỗn hợp mẫu chuẩn, mẫu huyết tương trắng; mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn 100 ng/ml và nội chuẩn 100 ng/ml. Chiết các mẫu theo quy trình. Hình 3.5 giới thiệu sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn và mẫu huyết tương trắng.